苹果树腐烂病菌根皮苷水解酶基因Vmlph1的功能

为明确根皮苷降解酶在苹果树腐烂病菌侵染过程中的作用,从苹果树腐烂病菌基因组序列中鉴定出候选根皮苷降解酶基因Vmlph1,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术构建Vmlph1敲除突变体,观察突变体营养生长状况、产孢情况以及致病力的变化;利用HPLC方法检测基因敲除对根皮苷降解速率的影响。结果发现,经PCR及Southern blot验证后获得Vmlph1基因的敲除突变体;与野生型菌株相比,突变体菌落颜色变白,生长速率和产孢能力显著降低;接种到叶片和枝条上,突变体致病力显著降低;突变体根皮苷降解能力与野生型没有显著差异;在根皮苷诱导下,野生型菌株黑色素合成调控转录因子Cmr1基因的表达量显著上调,但突变体Cmr1基因的上调倍数显著低于野生型菌株。表明,根皮苷降解酶基因Vmlph1与苹果树腐烂病菌营养生长、致病力、分生孢子的产生及黑色素合成有关。     

油菜菌核病发生流行与菌源量、气候因子关系分析及病情预测模型的建立

为探究油菜菌核病田间发生流行的影响因子并建立病情预测模型,采用田间调查法测定油菜田菌核密度、子囊盘密度、花朵带菌率,并分析了2008—2014年各气候因子与病叶率、成熟期茎秆病株率、病情指数之间的关系。结果显示,田间菌核密度、子囊盘密度、花朵带菌率与病叶率及成熟期茎秆病株率均呈极显著正相关;2月下旬至5月上旬日均气温及2月下旬至4月上旬日均相对湿度、降雨量及降雨天数与各年度成熟期病株率及病情指数均呈显著正相关,而日照时数与各年度成熟期病株率及病情指数均呈极显著负相关。以油菜盛花期花朵带菌率作为指标,可预测其田间成熟期病株率;以降雨量(x_2)、降雨天数(x_3)及日照时数(x_4)与各年度成熟期病株率(y_1)及病情指数(y_2)分别建立了预测模型y_1=15.47+0.07x_2+0.42x_3-0.03x_4和y_2=10.36+0.07x_2+0.38x_3-0.03x_4,其拟合度均最高,分别为99.07%和98.43%,可作为油菜成熟期茎秆发病株率及病情指数的预测模型。表明油菜菌核病菌源量和气候因子是影响病害发生流行的关键因子。     

玉米南方锈病菌的超微结构研究

认识玉米南方锈菌的超微结构特征和侵染过程的细胞学特征,可为南方锈菌致病机理和玉米抗锈机制研究提供重要依据。本研究采集玉米品种‘郑丹958’和‘先玉335’自然发病的南方锈病病叶,4%戊二醛固定液抽气固定,采用扫描电镜和透射电镜技术进行观察。结果表明,玉米南方锈病菌的胞间菌丝呈丝状,胞间菌丝和胞内菌丝细胞核在不同感病玉米品种之间具有单核或者双核的差异;胞间菌丝与寄主细胞接触诱导吸器母细胞的分化,吸器母细胞穿透寄主细胞壁在细胞内形成吸器;寄主细胞质膜在吸器的侵入部位内陷,随着吸器的发育,在吸器颈部周围形成胼胝质并将吸器颈部完全包围起来;夏孢子表面具密致、交错排列的刺突,刺突基部外围存在圆形凹陷的脊。本研究揭示了玉米南方锈菌基本超微结构特征和侵染机构(吸器)细胞学特征,并对其在不同品种细胞内的核相进行了分析,为玉米南方锈菌组织病理学研究奠定重要基础。     

筒鞘蛇菰内生真菌的分离及拮抗菌筛选

为了考察筒鞘蛇菰（Balanophora harlandii Hook. f.）内生真菌的类群组成，寻找高活性的抗菌物质，用组织块分离法和杯碟法筛选出能产生高抑菌活性的蛇菰内生真菌菌株。从神农架野生筒鞘蛇菰不同组织内共分离、纯化得到49株内生真菌，对其中生长良好的28株内生真菌归属于半知菌亚门丝孢纲的2目2科7个属，分别是丝核菌属（Rhizoctonia）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、地霉属（Geotrichum）、小孢霉属（Microsporum）、从梗孢属（Monilia）和粉孢属(Oidium)。这28株内生真菌对于3种供试靶标细菌表现不同的抑菌活性，其中SG47菌株的抑菌作用较强。这些内生真菌能够产生丰富的抑菌活性物质，极具从中寻找新型杀菌剂或药物先导化合物的潜力。     

植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌株对葡萄灰霉病菌的抑菌活性

通过室内皿内对峙抑菌试验、分生孢子萌发抑制试验、离体果实接种试验以及电镜技术，研究测定了分离自小麦根部的植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌液对葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea Pers.的抑制作用及抑菌机理。结果表明:用Em7菌液处理葡萄灰霉病菌后，在PDA培养基上形成了明显的抑菌圈，直径达2.81 cm；菌液对分生孢子萌发的抑制率达到88.65%；经Em7菌液处理后，离体果实病情指数明显低于空白对照，相对防治效果达到78.92%。电镜观察发现，处理组菌丝生长异常，体表凹凸不平，局部膨大成结或缢缩，分枝变多，菌丝体内液泡增多，细胞壁增厚，细胞膜透性发生变化。表明植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌株对葡萄灰霉病菌有良好的抑制作用，并且可以有效控制葡萄灰霉病的发生。     

芪合酶基因转化小白菜

利用质粒pBin438构建了含有NPTⅡ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)品种中,经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测,RS基因已整合到小白菜基因组中并得到了表达,共获得了7株转基因植株。     

茄链格孢菌侵染马铃薯叶片过程的细胞学观察

采用光学显微镜和电镜技术系统研究了茄链格孢菌对马铃薯叶片的侵染过程及超微结构特征。结果表明：接种2 h后,分生孢子开始萌发,分生孢子各个位置都可萌发产生芽管|接种6 h后,菌丝顶端出现附着孢|接种8 h后,菌丝从细胞间凹陷处直接侵入感病品种东农303叶片表皮细胞内|接种24 h后,受侵染寄主细胞中的菌丝向相邻细胞扩展蔓延,感病品种细胞内含物及各类细胞器基本完全消解。在抗病品种克新1号上,茄链格孢菌的侵染情况与感病品种基本一致,但发生时间明显较感病品种推迟,寄主细胞内的菌丝数量明显少于感病品种|并且在接种24 h后出现细胞壁加厚的防卫反应,在感病品种上没有观察到防卫反应现象。说明抗病品种对茄链格孢菌具有一定的抗侵入和抗扩展能力。     

PEG介导的Botryosphaeria dothidea突变体库表型分析及致病突变体筛选

对已建立的PEG突变体库中随机挑选的320株突变体菌株进行表型和致病性筛选,获得表型或致病性显著变化的菌株。将突变菌株及野生菌株接种至PDA培养基,观察生长3d和7d时菌落颜色及形态,测量菌落直径。将表型变化菌株及野生菌株接种于离体富士叶片,测量接种5d后病斑直径。生长速率检测显示有40株生长速率加快,有3株生长速率显著下降。14株突变体菌落颜色发生明显变化,菌落呈黑色或纯白色;15株突变体菌落形状不规则且气生菌丝稀疏;其中7株同时具有两种表型特征。致病性测定获得致病性增强突变体s104和致病性减弱突变体s172。所筛选的320株突变体中,表型异常菌株占6.8%,同时获得两株致病性变化菌株,对进一步揭示Botryosphaeria dothidea的致病机理具有重要价值。     

杀菌剂羟菌唑对油菜菌核病菌生长发育的影响

用电子显微镜技术和细胞化学技术,研究了羟菌唑对油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)生长发育的影响。扫描电镜观察发现,药剂处理后病菌菌丝生长明显受到抑制,菌丝粗细不均匀,呈不规则肿大或缢缩,分枝明显增多。超微结构研究表明,药剂处理后,病菌菌丝细胞壁不规则加厚,以菌丝顶端细胞壁加厚尤为明显,并有大量电子致密度高的物质存在;与对照菌丝相比,病菌菌丝隔膜肿大、畸形,发育受阻;有的菌丝体内有新菌丝产生,且染色较深。细胞化学标记分析结果表明,药剂处理后,病菌菌丝细胞壁的β-1,3-葡聚糖和几丁质的标记密度明显高于对照菌丝,说明药剂处理后,这2种成分在细胞壁内显著增加。病菌菌丝细胞壁成分的变化表明,羟菌唑影响了病菌细胞结构及其功能。     

大豆疫霉菌对大豆下胚轴侵染过程的细胞学研究

 接种后1.5~24h,用光镜和电镜研究了2个大豆品种与大豆疫霉菌Ps411的亲和性和非亲和性互作。观察结果表明,大豆疫霉菌对大豆下胚轴的侵染过程可分为侵入前、侵入、皮层组织中的扩展和进入维管束组织4个连续阶段。大豆下胚轴接种后在25℃保湿培养,1.5h后游动孢子即形成休止孢并萌发产生附着孢,3h后侵入表皮细胞,6h后进入皮层组织,24h后进入维管束组织。病原菌主要以侵染菌丝直接侵入表皮,表皮细胞间隙是主要侵入部位。皮层细胞是病原菌定殖和发展的主要场所,胞间菌丝侵入皮层细胞并形成吸器。在菌丝与寄主细胞接触部位的寄主细胞壁与质膜之间常有胞壁沉积物的形成。在抗病品种上病菌的侵染事件与感病品种基本一致,但不能形成正常的吸器,胞壁沉积物明显多于感病品种,菌丝在寄主组织内的扩展明显受到抑制。利用β-1,3-葡聚糖免疫金标记单克隆抗体进行的免疫细胞化学的研究表明,胞壁沉积物内含有大量的β-1,3-葡聚糖,在大豆疫霉菌菌丝壁中也存在β-1,3-葡聚糖。以上结果表明,病原菌的侵染可诱导抗病寄主细胞内β-1,3-葡聚糖迅速的合成与积累、并形成胞壁沉积物,以抵御病菌的侵染与扩展。