油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生，并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制，本文优化了影响农杆菌介导转化（ATMT）油菜黑胫病菌L. biglobosa菌株Lb731的因素，评估转化子质量，并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素：潮霉素B浓度为50 μg/mL，转化受体（分生孢子）培养时间为15 d (20℃)，浓度为2 × 10^7~8孢子/mL，农杆菌-受体共培养温度为25℃，共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%，单拷贝插入频率为72.7%，转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体，7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体，并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术，从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。     

西瓜果斑病菌T2SS分泌蛋白的筛选和功能预测

利用KEGG和STRING数据库分析比较瓜类果斑病菌(西瓜嗜酸菌)(Acidovorax citrulli,Ac)和主要植物病原细菌Ⅱ型分泌系统(T2SS)的基因组成,收集有试验证据的植物病原细菌T2SS分泌蛋白序列信息,与已测序并经注释的果斑病菌AAC00-1菌株基因组进行序列比对,筛选出候选的果斑病菌同源T2SS分泌蛋白。通过对筛选出的分泌蛋白的信号肽、代谢通路、蛋白互作网络及其在植物细胞中的定位进行分析,预测部分分泌蛋白的生物学功能。     

油菜黑胫病菌和茎基溃疡病菌的LAMP检测方法的建立

 油菜黑胫病和油菜茎基溃疡病分别由子囊菌Leptosphaeria biglobosa和L. maculans引起。我国油菜产区仅发现L. biglobosa,未发现L. maculans。因而, L. maculans是我国的对外检疫性对象。这两种真菌形态相似,引起的病害症状相似,给田间快速准确鉴定带来难度。本研究基于环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP),建立了快速检测L. biglobosa和L. maculans的方法。根据ITS-rDNA序列设计了5条检测L. biglobosa的LAMP引物和6条检测L. maculans的LAMP引物,检测L. biglobosa和L. maculans的最适温度为65℃,反应时间分别为40 min和50 min。两组引物检测特异性高,检测的模板DNA极限达到fg级,与常规PCR检测相比,LAMP检测L. biglobosa和L. maculans灵敏度分别提高了100倍和1000倍。在病害样品实际检测中,采用两种LAMP体系,分别检测了9株罹病油菜茎秆中的病原菌。结果表明:所有茎秆中的病原菌均为L. biglobosa,没有检测到L. maculans,与特异性PCR检测结果一致。本研究建立的LAMP检测方法为快速高通量检测L. biglobosa和L. maculans奠定了基础。     

链霉菌3-10发酵液及提取物的稳定性研究

为合理利用链霉菌3-10的代谢产物,本研究采用不同极性的有机溶剂提取链霉菌3-10发酵液中的抗真菌物质并得到发酵液的提取物.在此基础上测定了温度、紫外线辐射、酸碱度和贮存条件对3-10抗真菌物质稳定性的影响.结果表明,乙酸乙酯为最佳提取溶剂,链霉菌3-10发酵液的乙酸乙酯提取物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,提取后余...     

重寄生真菌盾壳霉胞外蛋白酶产生条件及酶活影响因子

重寄生真菌盾壳霉Coniothyrium minitans是核盘菌Sclerotinia sclerotiorum的重要生防菌。为了探讨盾壳霉胞外蛋白酶在寄生核盘菌过程中的作用,采用明胶平板法对盾壳霉寄生核盘菌菌核产生的蛋白酶活性进行了检测,并进一步采用福林酚法定量测定蛋白酶活性,研究盾壳霉产生胞外蛋白酶的培养条件及影响蛋白酶活性的因子。试验结果表明,在被盾壳霉寄生的核盘菌菌核中检测到蛋白酶活性,表明蛋白酶可能参与盾壳霉重寄生作用。发现核盘菌菌核浸出液培养基适合盾壳霉产生胞外蛋白酶,摇培(20℃、200r/min)5d时蛋白酶活性最高,达到0.22U/mL。盾壳霉胞外蛋白酶酶促反应的最适温度为60℃,最适pH7.0。当温度不高于40℃时,蛋白酶酶活较稳定。5mmol/L的金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Li⁺和K⁺等对蛋白酶酶活没有显著影响(P>0.05),而Fe²⁺(5mmol/L)显著(P<0.05)提高了蛋白酶活性。盾壳霉蛋白酶对苯甲基磺酰氟(PMSF)敏感,说明盾壳霉产生的胞外蛋白酶可能主要是丝氨酸蛋白酶。这些结果为盾壳霉胞外蛋白酶的分离纯化和功能研究奠定了基础。     

油菜内生细菌多样性分析及菌株CanL-30生防潜力评估

为筛选防病促生的内生性细菌菌株，提高油菜的抗病性，对武汉地区甘蓝型冬油菜内生细菌进行了分离鉴定和多样性分析，同时对分离的内生细菌进行了拮抗菌株和促生菌株的筛选。结果表明：从采集到的油菜样本中共分离得到134株内生细菌，基于16S rDNA序列分析，发现这些菌株属于18个细菌属中的33个种，其中芽孢杆菌属、假单胞菌属和寡养单胞菌属占优势，分别占分离物总数的46.27%、15.67%和11.94%。油菜根、茎和叶内生细菌分离物的香农多样性指数分别为2.847、2.808和2.356，辛普森指数分别为0.956、0.939和0.907。经过平板筛选、离体叶片筛选以及活体油菜接种筛选，发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株CanL-30对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和油菜黑胫病菌（Leptosphaeeria biglobosa）有拮抗作用，还具有稳定的抑制核盘菌的效果。进一步试验表明，菌株CanL-30主要通过产生抗真菌物质抑制核盘菌生长。研究还发现CanL-30能促进拟南芥和油菜生长。上述结果说明冬油菜存在丰富的内生细菌资源，从中可以筛选得到防病促生的细菌菌株。     

侵染葱鳞葡萄孢的一种新型dsRNA病毒

测定了葱鳞葡萄孢(Botrytis squamosa)菌株LeekBc-10和GarlicBc-2的菌丝生长速度、致病力和菌株LeekBc-10中一种dsRNA病毒的cDNA序列及其推定编码的蛋白质序列,并对该病毒进行了系统进化分析。结果表明:菌株GarlicBc-2菌丝生长较快、致病力较强,菌株LeekBc-10菌丝生长较慢、致病力较弱。菌株LeekBc-10菌丝中有2条dsRNA片段(dsRNA-1和dsRNA-2),序列测定表明:dsRNA-1和dsRNA-2核苷酸序列与相对应Botrytis porri RNA virus 1(BpRV1)中2条dsRNA片段的相似性分别为91.7%和97.7%,故可判断菌株LeekBc-10中的dsRNA是一种真菌病毒,暂时命名为Botrytis squamosa RNA virus 1(BsRV1)。BsRV1中dsRNA-1和dsRNA-2分别含有一个大的开放阅读框(ORF),即ORFⅠ和ORFⅡ,各自编码长度为1 901和1 788个氨基酸的假定蛋白,且分别与BpRV1中的对应假定蛋白的相似度为97.1%和98.7%。对BsRV1ORF I编码的假定蛋白的分析表明:该蛋白含有RdRp_4(RNA dependent RNA polymerase)超家族蛋白的保守结构域。BsRV1的RdRp与Totiviridae、Chrysoviridae和Megabirnaviridae等科病毒的RdRp同源性为19%~23%,且具有上述病毒RdRp的8个保守结构域。系统发育分析表明:BsRV1与BpRV1聚在一起形成一个独立分支,属于同一种病毒,且不能归到任何已有的病毒科中,因而可能代表一个新的病毒科。     

温度对油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）假囊壳和子囊孢子发育的影响

油菜黑胫病是双球小球腔菌（Leptosphaeria biglobosa）引起的一种真菌病害,在油菜产区广泛发生。为了解我国特定气候和栽培条件下的流行规律,通过室内试验和田间试验探讨了温度对罹病油菜茎秆上L. biglobosa 假囊壳和子囊孢子发育的影响。室内试验结果表明：在保证环境水分（湿度）充足的条件下,温度影响L. biglobosa 假囊壳和子囊孢子的发育进程。在4℃下培养105 d,成熟假囊壳比例仍低于1%,而在10、15、20和25℃下分别培养66.5、57.9、34.5和47.3 d后,成熟假囊壳比例达到50%。可见,10~25℃较4℃更适合L. biglobosa 假囊壳和子囊孢子发育。武汉的田间试验结果表明：L. biglobosa 越夏后（8月底）,在平均气温26℃和平均降雨量为2.7 mm/d的条件下,经过56.3 d成熟假囊壳的比例达到50%。L. biglobosa 越秋后（10月底）,在平均气温为12℃和平均降雨量为1.5mm/d条件下,仅需28.1 d成熟假囊壳的比例即达到50%。可见秋末冬初的环境条件较夏末秋初更加适合L. biglobosa 假囊壳和子囊孢子发育。研究结果还表明：L. biglobosa 子囊孢子在水琼脂培养基上培养2 h后（20℃）萌发率达到100%,萌发方式是两端细胞先萌发,中间细胞后萌发,子囊孢子能直接侵染油菜子叶,引起坏死病斑。     

油菜黑胫病研究进展

油菜黑胫病是一种世界性分布的真菌病害,由子囊菌Leptosphaeria biglobosa引起。近年来随着田间调查的深入,及其姊妹病害油菜茎基溃疡病（Leptosphaeria maculans引起）传入风险的增加,我国对油菜黑胫病的重视程度逐年增加。本文对油菜黑胫病病原菌种群、病害循环及危害症状、分布与寄主范围、分子检测技术以及综合防治等方面的研究进展进行了综述,分析了油菜茎基溃疡病菌对我国的侵入风险,同时对我国油菜黑胫病研究和防控提出了建议,并就此进行了展望。     

苏、日专属经济区捕鱼协定

在苏联莫斯科签定的1987年苏-日捕鱼协定分别允许对方在本国的经济区免费捕鱼210，000吨，比1987年增加10，000吨，协定特许日本方面另外增加捕鱼量100，000吨，但须付给苏方7．4百万英镑，这笔钱比1987年增加了1．8百万英镑。