草鱼肾细胞中双氟沙星代谢酶的酶动学

细胞色素P450s(CYPs)主要参与动物体内药物代谢。水产养殖中不合理的联合用药常会导致治疗失败,这通常与CYP活性的诱导有关。然而,关于鱼类CYP的诱导却知之甚少。为获得有关CYP诱导的信息,实验采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法测定了草鱼肾细胞(CIK)中CYPs的特异性诱导剂对双氟沙星(DIF)的代谢作用及酶动学分析。对照组和β-萘黄酮(BNF)诱导组的酶动学方程分别为1/V=0.1375×1/[S]+0.003和1/V=0.0245×1/[S]+0.0013。DIF与经BNF处理的CIK共孵育后,其代谢量增加了1倍,酶动学参数Clint和Vmax值分别增加了7倍和2倍。BNF是CYP1A的特异性诱导剂,因此,CYP1A可能参与了DIF的代谢。     

草鱼孕烷X受体与细胞色素P450 3A mRNA表达相关性初步研究

根据GenBank中斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)基因序列设计保守区域简并引物,通过PCR扩增获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PXR cDNA核苷酸序列片段为509 bp,经推导获取169 aa序列。对草鱼与其它物种PXR氨基酸序列进行同源性比较,用以鉴定其在物种中的进化。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测草鱼9种组织PXR和细胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A,CYP3A)基因mRNA相对含量,结果表明,其表达丰度依次为:前肠﹥肝脏﹥肾脏﹥鳃﹥肌肉﹥后肠﹥性腺﹥心脏﹥脾脏,CYP3A和PXR基因在草鱼组织中表达分布基本一致,在前肠、肝脏和肾脏高度表达,而在其它组织低度表达。为了进一步研究PXR和CYP3A基因表达相关性,通过细胞,特选用诱导剂利福平(rifampicin,RIF),最佳诱导浓度40μM,孵育1、2、4、6、8、10、12、24 h后,用qRT-PCR检测CYP3A-PXR基因动态表达过程。结果显示,诱导组CYP3A和PXR基因表达量均高于对照组,显示出显著诱导效应。     

条斑星鲽CYP19a基因克隆及其在雄鱼生殖周期中的表达

细胞色素P450芳香化酶(P450arom)作为P450细胞色素酶超家族中的一员,是性类固醇生成途径中的末端酶,能够将雄激素转化为雌激素。在大多数脊椎动物中,P450arom由CYP19单基因编码。但是在鱼类中存在两种P450芳香化酶,分为性腺型芳香化酶(P450aromA)和脑型芳香化酶(P450aromB),它们由不同的基因(CYP19a和CYP19b)编码,分布在不同的组织。通过简并引物扩增及RACE cDNA扩增克隆,在国内外首次获得全长为2167bp的条斑星鲽CYP19a cDNA序列,并将推测的氨基酸序列与其它物种P450arom氨基酸序列进行多重比较,发现存在跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。通过RT-PCR分析了P450aromA mRNA在条斑星鲽不同组织中的表达情况,结果表明,CYP19a基因主要在脑、卵巢和精巢中表达,其次在肠、肝脏、肾脏也有少量表达。同时也分析了P450aromA mRNA在处于不同发育期的精巢中的表达情况,发现在Ⅱ期精巢中表达量最高,在Ⅴ期精巢中表达量最低。     

福寿螺细胞色素P450基因CYP3192A1的克隆与表达分析

文章分析了福寿螺(Pomacea canaliculata)细胞色素P450(CYPs)的结构、表达特征及四聚乙醛代谢与细胞色素P450表达水平的相关性。应用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆获得福寿螺CYPs基因c DNA全长2 523 bp,命名为CYP3192A1,含1个开放阅读框(ORF),编码517个氨基酸,具有血红素结合区F**G***C*G、K螺旋(E**R)、I螺旋(AG*ET)、C螺旋(W***R)等高度保守序列及跨膜螺旋(12~34号氨基酸)。聚类分析显示福寿螺CYP3192A1是细胞色素P450新家族成员,与CYP3A亚家族序列同源性较高。荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-q PCR)分析显示,福寿螺CYP3192A1基因表达量存在显著的性别及组织差异性(P0.05),表现为雌性表达量高于雄性,肠和鳃表达量最丰富,肝和胃次之,心和腹足中少量表达;四聚乙醛对福寿螺CYP3192A1表达的影响为"低浓度诱导,高浓度诱导期缩短并提前"。结果表明四聚乙醛处理能够显著诱导福寿螺CYP3192A1表达,与CYP3192A1表达量增加紧密相关,福寿螺CYP3192A1过表达可能在四聚乙醛代谢抗性中起重要作用。     

草鱼肾细胞中细胞色素P450 3A基因诱导表达及其酶活性分析

采用基因克隆技术获取草鱼(Ctenopharyngodon idellus)细胞色素P450 3A(CYP3A)cDNA序列长1 849 bp,包含完整开放阅读框(open reading frame,ORF)1 542 bp,1个终止密码和含polyA信号3'UTR； ORF编码514个氨基酸,含信号肽(29 aa),2个跨膜螺旋区(23 aa,23 aa),血红素结合域(21 aa)和6个底物识别位点(SRSl-6)；与其他脊椎动物CYP3A氨基酸序列相似度达60％ ～ 92％.用实时定量PCR和分光光度计法分别研究了草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney cell line CIK)中利福平(rifampicin,RIF)诱导CYP3A基因表达和红霉素-N-脱甲基酶(ERND)活性,采用红霉素脱甲基酶活性法测定CYP3A的活性.结果显示,诱导组CIK细胞中CYP3A mRNA表达量在8最高,而CYP3A酶活在10h最高；CYP3A mRNA和酶活性与对照组均具显著差异性（P<0.05）.CYP3A转录水平先于相应酶活变化表达,且转录水平表达显著高于酶活性,这很可能反映了RIF对CYP3A的诱导主要作用于转录水平而不直接作用于酶活,本研究旨为药物对CYP3A转录调控和活性调节提供科学依据,并为渔药代谢酶的研究提供理论依据.     

草鱼肝微粒体的提取及CYP酶活性的测定

CYP酶代谢是药物生物转化的主要途径,其数量和活性大小直接影响药物在体内的活化与代谢。我们对草鱼肝微粒体CYP酶含量及其活性进行了初步研究,以差速离心法提取草鱼肝微粒体,以CO还原差示光谱法测得CYP酶及细胞色素b5含量分别为0.619±0.102 nmol/mg、0.264±0.042 nmol/mg。以7-乙氧异吩噁唑酮-O-脱乙基反应、苯胺-4-羟化反应、氨基比林-N-脱甲基反应作为CYP1A、CYP2E、CYP3A的探针反应,测得EROD酶活为0.043±0.004 nmol/mg/min,ANH酶活为0.028±0.002 nmol/mg/min,AMND酶活为0.207±0.035 nmol/mg/m in。结果表明草鱼肝微粒体中CYP酶发育完好,并且具有参与药物代谢的3种主要亚型活性,其含量与活性大小与其它实验动物相差较大。本实验的方法与结果为草鱼CYP酶的系统研究提供可靠手段,最终为指导水产合理用药提供理论依据。     

异育银鲫P450家族CYP3A136基因的克隆与表达

根据5种硬骨鱼已知CYP3A序列保守区设计兼并引物,以异育银鲫cDNA为模板扩增得到CYP3A基因片段,根据得到片段序列设计特异引物并利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长cDNA。得到异育银鲫CYP3A基因全长为1 769 bp,开放阅读框为1 545个核苷酸,编码514个氨基酸。其预测蛋白质分子量为58.624 ku,理论等电点为6.30。将异育银鲫CYP3A序列理论编码氨基酸序列提交细胞色素P450命名委员会(Cytochrome P450 Nomenclature Committee)并由其命名为CYP3A136。氨基酸序列分析显示,其与稀有鮈鲫、草鱼、鲦同源性较高,并且具有高度保守的血红素结合区域FXXGXXXCXG。异育银鲫CYP3A基因的半定量RT-PCR显示,在肝和肠组织中转录水平最高,在肾和鳃中次之,其余组织较低。     

三疣梭子蟹CYP302a1基因克隆及其表达分析

细胞色素P450(CYP)302a1是昆虫蜕皮激素合成通路中的关键酶,为了研究其在三疣梭子蟹蜕皮过程中的调控作用,实验采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到了三疣梭子蟹CYP302a1全长cDNA序列(GenBank登录号:KM596851).该序列全长为3 171 bp,包含一个长度为1 626 bp的开放阅读框,编码541个氨基酸;序列分析显示该氨基酸含helix-C、helix-K、helix-I、PERF及heme-binding共5个P450特征保守区域;系统进化树分析发现三疣梭子蟹CYP302a1与日本剑水蚤CYP302a1聚为一小支,再与其他物种CYP302a1聚为一支.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了CYP302a1在不同组织和蜕皮过程中的表达水平变化.结果显示,CYP302a1的表达量在Y器中最高,而在其他组织中均极低(P＜0.05);蜕皮过程中,CYP302a1在蜕皮后期(A、B期)表达量最低,从蜕皮间期(C期)开始上升,至蜕皮前期的D1亚期达到最大值,随后下降.结果表明CYP302a1在三疣梭子蟹蜕皮调控中可能起着重要作用.     

黄芩苷与甘草酸对恩诺沙星在异育银鲫体内代谢的影响

将黄芩苷(baicalin,BL)和甘草酸(glycyrrhizin,GZ)口灌异育银鲫(Carassius auratus gibelio),探讨其对恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)在体内的代谢和肝微粒体细胞色素氧化酶CYP1A、CYP3A活性的影响。异育银鲫连续7 d分别口灌黄芩苷(100 mg/kg)和甘草酸(100 mg/kg),以口灌玉米油作为对照。末次给药24 h后每组随机取10尾腹腔注射恩诺沙星(10 mg/kg),采用单个动物连续采血,HPLC测定血浆恩诺沙星和其代谢产物环丙沙星(cipmfloxacin,CIP)浓度,分析药动学及其参数;同时每组选取6尾检测肝微粒体CYP1A和CYP3A活性。结果表明:(1)黄芩苷(BL)和甘草酸(GZ)对恩诺沙星的吸收有明显抑制作用,主要表现在恩诺沙星峰浓度(Cmax)降低,曲线下面积(AUC)减少;(2)口灌BL和GZ后,恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的消除半衰期(t1/2z)明显小于对照组(P<0.05),而总体清除率(CLz/F)则增大,说明黄芩苷和甘草酸促进了恩诺沙星和环丙沙星的消除;(3)口灌BL和GZ后,BL组和GZ组的Cmax-CIP/Cmax-ENR比值分别为1.48%、2.22%,对照为0.95%;BL组和GZ组的AUC0-t-CIP/AUC0-t-ENR比值分别为2.16%、1.76%,对照组为1.7%。综合分析代谢产物环丙沙星峰浓度、Cmax-CIP/Cmax-ENR和AUC0-t-CIP/AUC0-t-ENR比值可以得出,黄芩苷和甘草酸对恩诺沙星N-脱乙基具有诱导作用;(4)与对照组相比较,BL组和GZ组的7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD,CYP1A标志酶)和红霉素-N-脱甲基酶(ERND,CYP3A标志酶)活性显著升高(P<0.05),说明黄芩苷和甘草酸对CYP1A和CYP3A都有诱导作用。结合以上结果,认为黄芩苷和甘草酸加速了恩诺沙星的消除和其代谢产物CIP的生成,很可能与诱导CYP1A和CYP3A活性有关。     

维生素C对异育银鲫原代肝脏细胞活性及抗敌百虫氧化胁迫的影响

南京农业大学动物科技学院,江苏省水产动物营养重点实验室,江苏南京210095用含不同浓度维生素C(0,50,100,200,400和800 μmol/L)的培养液培养异育银鲫原代肝脏细胞,待细胞融合后,测定细胞活性、细胞内维生素C含量,乳酸脱氢酶(LDH)活性.再将用维生素C培养的肝脏细胞经敌百虫胁迫24 h,测定细胞内总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和丁酰胆碱酯酶(B-ChE)活性以及细胞内细胞色素P450( CYP450)含量.结果表明,与未添加维生素C组相比,在100 μmol/L的维生素C剂量组,肝脏细胞活性显著高于较其它剂量组(P＜0.05)；细胞内维生素C的含量随着培养液中维生素C的增加而增加,且差异显著(P＜0.05)；在800 μmol/L维生素C剂量组,细胞LDH活性显著增加(P＜0.05),但是其它剂量组均无显著变化.肝脏细胞经敌百虫胁迫后,在50、100和200μmol/L维生素C剂量组,细胞T-AOC能力,GST活性,B-ChE活性和CYP450含量显著升高(P＜0.05),细胞解毒和抗氧化能力增强；但是当维生素C的剂量为400和800 μmol/L时,细胞T-AOC能力和GST活性降低.综上所述,在体外细胞培养液中添加在50 ～ 200μmol/L剂量范围的维生素C可以促进原代肝脏细胞生长,增强细胞解毒能力,提高细胞的抗氧化水平.     

CYP3A65及上游核受体基因PXR和AHR2在斑马鱼生长发育阶段的表达

为了选择处于最佳生长阶段的斑马鱼用于药物代谢研究,本实验考察不同生长阶段斑马鱼全鱼、肝脏和肠道组织中CYP3A65及其上游核受体基因(PXR、AHR2) mRNA表达水平的变化规律。实验测定CYP3A65、PXR和AHR2相对表达量,并通过比较核受体基因与代谢酶基因mRNA之间的相关性来证实核受体基因的调控作用。结果显示,144 hpf和75 dpf两个生长阶段的斑马鱼中CYP3A65、PXR和AHR2 mRNA表达量最高;斑马鱼生长阶段中代谢酶基因和核受体基因的表达趋势一致,且受肝脏、肠道组织占全鱼比重的影响。研究表明,幼鱼期144 hpf斑马鱼及稚鱼期75 dpf的斑马鱼最适用于CYP3A65代谢研究;CYP3A65与PXR、CYP3A65与AHR2的mRNA表达之间有显著的相关性,与AHR2的相关性更显著。     

大口黑鲈原代肝细胞的培养及其应用于CYP450活性的诱导

体外培养大口黑鲈(Micropterus salmoides)原代肝细胞,观察其在培养过程中的形态变化,同时检测培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALb)含量,从而判定肝细胞的增殖和代谢能力,进而应用于CYP450的诱导研究。结果表明:培养5 d后,肝细胞连接成片,分裂增多;培养至7 d,细胞渐至单层;14 d后,细胞停止生长,出现老化迹象。培养至第3~4天的细胞上清液中LDH的渗出量呈上升趋势,在第4天时达到峰值,随着培养时间的延长,肝细胞的酶渗出量逐渐减少。ALb的分泌量在第3~5天呈上升的趋势,第4~8天维持在较高水平,在第5天达到最高,此后随着培养时间的延长,ALb的分泌量呈下降趋势,故选择培养至第5天的大口黑鲈肝细胞应用于CYP450酶系中的氨基比林-N-脱甲基酶(ANDM)的诱导研究。40μM利福平诱导24 h后,ANDM活性最高。ANDM的诱导研究为鱼类细胞药物代谢酶体外诱导奠定基础。     

拟穴青蟹CYP302a1基因的克隆及表达模式分析

蜕皮激素对节肢动物生长、发育和繁殖有重要调控作用,细胞色素P450(CYP)302al是蜕皮激素合成通路中的关键酶。克隆获得了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)CYP302a1基因,命名为Sp-CYP302a1。Sp-CYP302a1的cDNA序列长为3 032 bp,包含一个1 617 bp的开放阅读框(ORF),可编码538个氨基酸,预测相对分子质量为61.14 kDa。序列分析结果显示,该氨基酸含helix-K、helix-C、helix-I、PERF及heme-binding 5个P450特征保守区域。系统进化分析表明,Sp-CYP302A1与其他物种的CYP302Al聚为一类,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的进化关系最近。qRT-PCR分析发现,雌蟹和雄蟹中CYP302a1均在Y器官具有最高表达,而在其他组织中的表达量相对较低。在幼体发育过程中,CYP302a1在蚤状幼体Ⅲ期出现一个表达峰值,但在其他几个时期的表达量均较低。在蜕皮周期内,CYP302a1表达量变化显著,在蜕皮后期(A、B期)表达量最低,随后开始上升,至蜕皮前期(D期)达到最大值,随后开始下降。综上,研究从序列分析方面鉴定了拟穴青蟹的CYP302a1,并对该基因进行了表达模式综合分析,结果表明其可能在拟穴青蟹蜕皮以及幼体发育调控中具有重要作用。     

乙醇对CHSE-1细胞中细胞色素P450 2E1的诱导研究

以乙醇为细胞色素P450 2E1的诱导剂,在CHSE-1细胞中研究了该诱导剂与酶活性之间的时间效应关系和剂量效应关系。细胞传代后培养48 h,加入含有不同浓度乙醇的新鲜培养基,孵育诱导24 h,之后加入底物苯胺反应30 min。以苯胺的代谢产物4-氨基酚的生成量来反映CYP2E1活性。苯胺浓度为10～16 mmol/L时CYP2E1活性最大,可达(0.152±0.095)nmol.min-1.mg-1,该浓度范围的苯胺适合用于指示CYP2E1的活性。以Gentox模型对诱导的剂量效应进行拟合,得到一个先升高后降低的曲线,说明乙醇对CHSE-1细胞中CYP2E1有先诱导后抑制作用。拟合方程F(x)=(p0 kx)/(1 〔x/EC50〕nH)参数P0为0.140,nH为2.456,k为0.024,EC50为34.938。CYP2E1酶活性随着诱导时间的增加逐渐增强,24 h内酶活性随时间的增加而增强,可达(0.446±0.092)nmol/(min.mg),呈典型的酶诱导现象,建立了乙醇对CHSE-1中CYP2E1的诱导模型。     

紫贻贝产卵前后转录组分析与相关基因的筛选

为探究紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)雌性生殖相关基因在产卵过程中发挥的功能及其参与产卵活动的调控机制,对紫贻贝产卵前后的性腺组织进行了转录组测序分析。结果显示,紫贻贝产卵前后存在的差异表达基因为4060个,其中上调的基因数目为1488个,下调的基因数目为2572个。GO富集分析显示,这些差异基因主要参与生长、发育过程、生殖、生殖过程等生殖相关的生物学途径。KEGG富集分析显示,与产卵、生殖相关的信号通路包括TCA循环、GnRH信号通路、卵巢类固醇生成、雌激素信号通路、催产素信号通路、类固醇生物合成等能够被显著富集。荧光定量分析结果显示,促黄体生成激素β (LHβ)和基质金属蛋白酶14 (MMP14)基因表达水平显著升高,促性腺激素释放激素受体(GnRHR)、细胞色素P4503A酶(CYP3A)、细胞色素P45017A酶(CYP17A)基因表达水平显著下降。本研究利用转录组学分析了紫贻贝在产卵前后性腺组织转录水平的差异,揭示了紫贻贝性腺组织中参与调节产卵过程的主要途径和候选基因,为进一步阐明紫贻贝产卵活动的内在调控机制提供数据支撑,也为紫贻贝苗种繁育提供理论...     

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。     

黄曲霉毒素B1对黄颡鱼幼鱼生长及肝脏功能的影响

为研究黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)对黄颡鱼幼鱼生长、肠道消化酶及肝脏功能的影响,用添加不同梯度黄曲霉毒素B1(AFB1)(0、50、100和200μg/kg)的4种等氮等脂配合饲料饲喂初始体质量为(6.00±0.10) g的黄颡鱼幼鱼8周。结果显示:(1)饲料中添加AFB1对黄颡鱼幼鱼的存活率、饲料系数和特定生长率等均无显著影响,但使胰蛋白酶活性显著提高,而高含量AFB1(100和200μg/kg)显著降低肠道淀粉酶和脂肪酶活性;(2)随着AFB1添加量的上升,血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性及葡萄糖、甘油三酯、总胆汁酸和总胆固醇含量显著升高,肝脏中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性显著下降;(3) AFB1添加组的肝脏过氧化氢酶活性和丙二醛含量显著高于对照组,100和200μg/kg AFB1组超氧化物歧化酶活性显著高于对照组,其余各组无显著差异;(4) AFB1添加组肝脏sod基因及炎性因子il-1β基因的相对表达量显著上调,200μg/kg AFB1组cat基因及炎性因子il-8、il-10相对表达量显著上调;(5)通过组织学观察,AFB1会引起部分肝细胞出现轻微萎缩、肝细胞核移位、细胞界限模糊和肝细胞内空泡化的现象。研究表明,在本实验条件下,饲料中AFB1含量低于200μg/kg不影响黄颡鱼幼鱼生长性能,但饲料中AFB1≥50μg/kg时会影响黄颡鱼幼鱼肠道的消化吸收功能,同时引起肝脏氧化应激及炎性反应,造成肝脏功能损伤。     

罗氏沼虾细胞色素P450家族CYP302a1基因克隆及其在蜕皮周期中的表达

蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1859 bp,开放阅读框(ORF)为1629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。     

不同倍性鲫鲤性腺型芳香化酶cyp19a1a基因cDNA的克隆及表达

为研究性腺型芳香化酶P450aromA(cyp19a1a基因编码)在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的作用,实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤的cyp19a1a基因cDNA全长。结果显示,3种鱼cyp19a1a基因均编码517个氨基酸残基,而且编码的蛋白都包含P450aromA特有的跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol’s肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。采用RT-PCR分析cyp19a1a基因mRNA在3种不同倍性鱼类组织中的表达情况,结果显示,cyp19a1a基因主要在实验鱼的卵巢中表达,其次在精巢、脑、脾脏有少量表达。采用实时荧光定量PCR对cyp19a1a基因mRNA在不同倍性鱼卵巢中的表达进行分析,结果发现,cyp19a1a基因在不同倍性鱼的非繁殖期卵巢的表达都高于繁殖期卵巢,并且在繁殖期和非繁殖期,cyp19a1a基因在三倍体湘云鲫的表达量高于二倍体红鲫和四倍体鲫鲤。采用免疫组织化学方法对CYP19A蛋白在不同倍性鲫鲤卵巢中的定位进行分析,结果发现,CYP19A蛋白主要定位在滤泡细胞、Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上以及Ⅱ时相卵母细胞的卵浆中。研究表明,性腺型芳香化酶在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的表达存在一定的差异性,三倍体鱼cyp19a1a基因mRNA水平表达异常,推测与其不育有关联性。     

黄芩苷对牙鲆肝CYP1A酶活性及基因表达的影响

本研究以中药黄芩苷为受试药物,研究其在不同剂量和作用时间下对牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝CYP1A酶活性和基因表达的影响。采用体内实验,将黄芩苷按低(50mg/kg·d)、中(100mg/kg·d)、高(200mg/kg·d)3个剂量分别口灌牙鲆,连续给药,并分别于给药3d、6d、9d后取样,测定CYP1A酶活性。结果表明,较空白组而言,给药3d,黄芩苷各剂量组鱼肝中EROD酶(CYP1A标志酶)活性没有明显变化(P0.05);给药6d,高剂量组的EROD酶活性极显著增加(P0.01),中剂量组的则显著增加(P0.05);给药9d,高、中剂量组的EROD酶活性均极显著增加(P0.01),低剂量组的EROD酶活性显著增加(P0.05),且黄芩苷对该酶的诱导作用与剂量和药物作用时间均呈正相关。半定量RT-PCR结果表明,各药物剂量组的CYP1A基因表达水平都发生了上调,且这种表达上调的幅度同CYP1A酶的活性一样,随给药时间和剂量的增加而加强,提示黄芩苷作为诱导剂对CYP1A酶活性的作用机制可能与调控CYP1A的转录水平有关。