宽口裂腹鱼尾鳍细胞系的建立及其应用

宽口裂腹鱼为塔里木河水系的特有物种。为建立其尾鳍细胞系，笔者采用组织块法和胰酶消化法相结合，分别用含胎牛血清的DME/F12培养基体外培养尾鳍组织。初步建立宽口裂腹鱼尾鳍细胞系，细胞传代培养至45代。细胞呈悬浮生长，最适培养液为DME/F12,最适胎牛血清质量分数为20%,最适温度为25℃。第10代细胞的群体倍增时间为24.94 h,细胞呈“S”型生长。第6代细胞液氮冷冻保存180 d后复苏，经台盼蓝染色计数，(88.72±0.99)%的宽口裂腹鱼尾鳍细胞系具有活性，复苏后增殖速度快，可正常传代。细菌、真菌、支原体的鉴定未发现污染。第10代细胞线粒体16S rRNA基因测序结果与GenBank中基因序列做一致性对比，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系与NC036933.1的一致率达99.91%,从分子水平证明，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系来自宽口裂腹鱼。NaCl质量分数为8‰时，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系的相对增殖率最高；NaHCO₃质量浓度为7 g/L时，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系的相对增殖率最高；宽口裂腹鱼尾鳍细胞系的相对增殖率随盐碱度增加呈先升后降趋势。     

塔里木裂腹鱼尾鳍细胞系的建立及盐碱度对其增殖的影响

为了建立塔里木裂腹鱼(Schizothorax biddulphi)尾鳍细胞系,本研究采用组织块法,分别用含胎牛血清(FBS)的DME/F12培养基体外培养塔里木裂腹鱼尾鳍组织,初步建立了塔里木裂腹鱼尾鳍细胞系(BICF1)。采用MTT法测定分析盐度(NaCl)和碱度(NaHCO3)对其增殖的影响。结果显示,BICF1悬浮培养传至45代,最适培养液为DME/F12,最适FBS浓度为20%,最适温度为25℃。第10代BICF1的群体倍增时间为28.11 h,呈“S”型生长。第6代BICF1液氮冻存180 d后复苏,经台盼蓝染色计数,BICF1有(87.85±0.66)%的细胞具有活性,复苏后可增殖并传代。BICF1无细菌、真菌、支原体污染。第10代BICF1线粒体16S rRNA测序结果与GenBank基因序列进行一致性对比,结果显示,BICF1与JQ844133.1的一致率为100%,表明BICF1来自于塔里木裂腹鱼。BICF1增殖数量在盐度为1、2、4、6时呈上升趋势,在盐度为6、8、10时呈下降趋势;盐度为6时,BICF1增殖数量最高。BICF1增殖数量在碱度为2、3、4、5、6 g/L时呈上升趋势,在碱度为6、7、8、10 g/L时呈下降趋势;碱度为6 g/L时,BICF1增殖数量最高。细胞增殖数量随盐碱度增加呈现先升高后下降的趋势。本研究旨在为合理开发和利用塔里木裂腹鱼遗传资源以及建立和保护其种质资源提供一定的科学依据。     

齐口裂腹鱼鳃丝细胞系的建立、鉴定及免疫研究

齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)是长江上游水域的珍稀鱼类, 近年来由于环境变化和疾病爆发野外齐口裂腹鱼数量急剧减少, 现已被列入长江上游二级急切保护的特有鱼类, 因此, 对齐口裂腹鱼的保护刻不容缓。建立齐口裂腹鱼细胞系是保护其种质资源的有效手段, 也可以在不伤害现有鱼群的条件下进行多种齐口裂腹鱼相关生物学研究。本研究建立了首个来源于齐口裂腹鱼的细胞系, SPG 细胞系。原代细胞分离自齐口裂腹鱼鳃丝组织, 呈均一的上皮状, 使用含 15%血清的 L-15 培养, 在 15 个月时间里成功传至 55 代。线粒体 COI 基因鉴定, 证明该细胞来源于齐口裂腹鱼, 核型检测细胞染色体数目为 2n=96。在液氮中保存 12 个月的细胞, 复苏后能保持 75%以上活力。EGFP-N3 质粒转染 SPG 细胞后观察到明显的绿色荧光蛋白表达。病毒类似物 poly(I:C)和大肠杆菌脂多糖 LPS 可引起细胞 IL-1β、IL-8、TNFa 和 TLR22 等免疫相关基因表达量升高。表明本研究建立的齐口裂腹鱼鳃丝细胞系可用于免疫学研究。此外, 此细胞系还将在种质保存, 外源蛋白表达和齐口裂腹鱼体外生物学研究中发挥重要作用。     

青鱼鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植培养技术,对来源于青鱼(Mylopharyngodon piceus)的鳍条组织细胞进行原代培养,建立了青鱼鳍条组织细胞系,定名为BC-Fin。青鱼鳍条组织细胞为成纤维样细胞,已稳定传代培养50多代,其最适培养温度为25℃,最佳培养基为L-15,最适血清浓度为15%,在最适培养条件下,青鱼鳍条组织细胞的群体倍增时间为60.6 h。青鱼鳍条组织细胞液氮冷冻保藏6个月后,经台盼蓝染色,约(90.09±4.65)%的细胞具有细胞活性,复苏后的细胞生长旺盛。细胞染色体分析显示,第16代青鱼鳍条组织细胞的染色体数目为正常二倍体(2n=48),第41代细胞染色体众数为46。通过对离体培养细胞的线粒体中的16S rRNA基因进行特异性扩增,获得长度为320 bp的核酸片段,核酸序列比对分析结果表明,其与青鱼16S rRNA基因序列的一致性达98%,表明该细胞来源于青鱼。病毒敏感性试验结果显示,在感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)后BC-Fin细胞系可产生典型细胞病变效应,病毒滴度为105.33±0.21TCID50/m L,且PCR检测可检测出细胞培养的草鱼呼肠孤病毒,表明BCFin细胞系对草鱼呼肠孤病毒较敏感。     

罗非鱼肾脏细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植法，对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的肾脏组织细胞进行原代培养，建立了罗非鱼肾脏细胞系，已稳定传代培养50代以上，命名为TiK。罗非鱼肾脏细胞系为纤维样细胞，其最佳培养基为DMEM，最适培养温度为28℃，最适血清浓度为15%。在最适培养条件下，罗非鱼肾脏细胞系的群体倍增时间为45.8 h。细胞经液氮冷冻保存6个月后进行复苏，经台盼蓝染色，约（89.84±3.48）%的细胞具有活性，复苏后细胞生长旺盛。染色体分析显示，第32代罗非鱼肾脏细胞系染色体数目分布在20~66之间，众数为48。使用本实验室分离鉴定的罗非鱼病毒感染罗非鱼肾脏细胞，可产生典型的细胞病变效应，表明罗非鱼肾脏细胞对该病毒敏感。该细胞系的建立为罗非鱼病毒病防控技术研究提供了重要的实验材料。     

基于COI基因探讨塔里木河流域裂腹鱼属鱼类的亲缘关系

裂腹鱼属(Schizothorax)是塔里木河流域分布的裂腹鱼亚科(Schizothoracids)鱼类中数量和种类最多的鱼类, 具有重要的生态学研究价值。本研究对采自塔里木河和伊犁河流域的 6 种裂腹鱼属鱼类的 COI 基因序列进行了分析。结果显示, 在 419 尾个体中共发现 25 个单倍型; 塔里木裂腹鱼(Schizothorax biddulphi)塔里木河主要支流群体、 宽口裂腹鱼(S. eurystomus)、重唇裂腹鱼(S. barbatus)和厚唇裂腹鱼(S. irregularis)之间的遗传距离小于 0.005, 未形成明显的“条形码间隙”。而塔里木裂腹鱼车尔臣河群体与其他物种间的遗传距离符合 2%阈值或 10 倍原则; ABGD 和 TaxonDNA 分析结果相同, 把新疆裂腹鱼属鱼类划分为 4 个组别, 塔里木裂腹鱼塔里木河主要支流群体、宽口裂腹鱼、重唇裂腹鱼和厚唇裂腹鱼分为一组, 伊犁裂腹鱼(S. pseudaksaiensis)、银色裂腹鱼(S. argentatus)、塔里木裂腹鱼车尔臣河群体分别划分为另外 3 个组别中; 贝叶斯法(BI)系统发育树中塔里木裂腹鱼车尔臣河群体形成了独立的分支, 节点支持率为 100%, 而塔里木裂腹鱼塔里木河主要支流群体、宽口裂腹鱼、重唇裂腹鱼和厚唇裂腹鱼未能形成独立的分支。BI 树拓扑结构与 ABGD 和 TaxonDNA 分组结果一致。塔里木裂腹鱼塔里木河主要支流群体、宽口裂腹鱼、重唇裂腹鱼和厚唇裂腹鱼可能存在种间杂交或尚未达到物种分化程度, 而塔里木裂腹鱼车尔臣河群体可能已分化成独立的物种。     

斑点叉尾鮰肾脏组织细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植培养技术，对来源于斑点叉尾鮰（lctalurus punctatus Rafinesque）肾脏组织的细胞进行原代培养，建立了斑点叉尾鮰肾脏组织细胞系，定名为CCK，目前已稳定传代培养70多次。斑点叉尾鮰肾脏组织细胞为成纤维样细胞，最佳培养基为M199，最适培养温度范围为28～32℃，培养基血清体积分数为10％。在此条件下，CCK细胞的倍增时间为38．9～41．0h。斑点叉尾鮰肾脏细胞的集落形成效率为（74．16±3．54）%，第9代传代细胞的染色体数目为正常二倍体2n=58，第33代传代细胞的染色体众数为60。液氮冷冻保存6个月后复苏的细胞经台盼兰染色检验，（86．69±1．04）％的细胞仍保持活性，细胞复苏后培养生长旺盛。通过对第17代离体培养细胞的28S rRNA基因进行PCR扩增及序列分析与比对，表明该细胞系来源于斑点又尾鮰。     

新疆叶尔羌河流域4种裂腹鱼多变量形态学对比分析

为明确叶尔羌河流域4种裂腹鱼的表型差异，实验整合传统形态学和框架分析法2个数据体系，利用多变量形态学统计分析法对叶尔羌河流域裂腹鱼类(4种，494尾，48组参数)开展分析。单因子方差分析结果显示，9个参数同时在4种裂腹鱼中存在显著差异，差异主要位于头部、前躯干部和后躯干部；主成分分析结果显示，重唇裂腹鱼与厚唇裂腹鱼形态数据在PC1轴上差异显著，主要反映头部特征；而框架数据结果显示，塔里木裂腹鱼和宽口裂腹鱼在第一主成分上差异较大，主要体现在后躯干部；2个数据体系逐步判别分析分别选取8个和6个主要参数建立判别公式，初始判别成功率分别为85.7%和75.7%，散点图组质心分离，样品重叠少；聚类分析结果显示，2个数据体系均分为2个分支，其中重唇裂腹鱼单独成一支，塔里木裂腹鱼与厚唇裂腹鱼在形态上距离较近，与宽口裂腹鱼次之。研究表明，2个数据体系中，形态数据表现较优于框架数据；叶尔羌河流域4种裂腹鱼外部形态存在显著差异，利用多元统计方法可以较好区分，但仍存在一定的重叠。     

斑石鲷肾脏细胞系的建立、特征分析及其免疫相关基因的表达分析

斑石鲷(Oplegnathus punctatus)是我国重要的海水养殖鱼类, 本研究以斑石鲷肾脏组织为材料, 建立了斑石鲷肾脏组织细胞系(O. punctatus kidney cell line, OPK)。斑石鲷肾脏细胞系生长旺盛, 目前已成功传至 34 代。本研究检测了不同 FBS 浓度对斑石鲷肾脏细胞生长的影响, 结果表明最适生长 FBS 浓度为 20%。将 OPK 细胞液氮冷冻复苏后, 细胞具有活性, 可正常生长和传代。核型分析结果显示, 第 24 代斑石鲷肾脏细胞系核型为正常二倍体核型(2n=2sm+46t)。将 Cy3-siRNA 转染到 OPK 细胞后, 可以成功表达荧光。对斑石鲷 OPK 细胞提取 DNA, 用斑石鲷线粒体色素细胞 C 氧化酶 I (CO I)基因进行检测, 结果表明该细胞系来源于斑石鲷。斑石鲷肾脏细胞系细胞在受到脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(poly I∶C)刺激后能产生免疫反应, 免疫相关基因 IκB、IL-1β、IL-8 和 IRF3 的表达水平发生显著变化。本研究成功建立了斑石鲷肾脏细胞系, 可运用于斑石鲷基因功能分析、细胞遗传学、致病性细菌和病毒感染机制等研究, 可为斑石鲷的基础研究和细胞工程育种等提供重要的基础材料。     

南疆地区四种土著裂腹鱼类幼鱼对氯化钠和碳酸氢钠的急性耐受能力

为了解新疆土著鱼类幼鱼氯化钠和碳酸氢钠胁迫下机体耐受性，本研究采用单因子急性毒性实验法，以斑重唇鱼（Diptychus maculates）、厚唇裂腹鱼（Schizothorax irregularis）、宽口裂腹鱼（S.eurystomus）、重唇裂腹鱼[S.（Racoma）davidi]4种5月龄裂腹鱼幼鱼为研究对象，对其氯化钠和碳酸氢钠的急性耐受能力进行研究。实验结果显示，4种裂腹鱼的24 h和96 h的氯化钠半致死浓度(LC₅₀)分别为9.9、12.8、9.3、12.6 g/L和6.5、8.6、6.2、10.0 g/L,安全质量浓度分别为0.7、0.9、0.6、1.0 g/L,氯化钠急性耐受能力为：重唇裂腹鱼>厚唇裂腹鱼>斑重唇鱼>宽口裂腹鱼。4种裂腹鱼的24 h和96 h的碳酸氢钠半致死浓度(LC₅₀)分别为112.3、107.2、110.9、86.3 mmol/L和88.5、81.3、94.3、72.1 mmol/L,安全质量浓度分别为8.9、8.1、9.4、7.2 mmol/L,碳酸氢钠急性耐受能力为：宽口裂腹...     

久效磷对中国对虾细胞超微结构的影响：Ⅱ.对肠的毒性效应

１９９４年７－１０月，作者取青岛市水产局养殖公司的平均体长１０．３ｃｍ的中国对虾，在实验室内用０．１０ｍｇ／Ｌ久效磷海水溶液处理，分别在处理４８ｈ、９６ｈ时取尚存活对虾的中肠组织样品，用常规方法固定和制样，利用透射电子显微镜对中国对虾中肠细胞的眼微进行观察。     

长白猪皮下脂肪细胞大小的发育性变化

本实验利用改进的石蜡切片、HE染色法测定了初生、1-4月龄5个阶段的20头长白猪皮下脂肪细胞大小并进行最小二乘均数分析和多重比较。结果表明:长白猪的皮下脂肪细胞直径初生时为53.54μm,1月龄增大到62.20μm,2月龄最低为43.36μm,随后的3、4月龄逐渐缓慢增加到64.56μm、72.49μm。     

显微注射技术在制备鱼类嵌合体和转基因海水鱼上的应用

以鱼类胚胎细胞和胚胎干细胞为核供体进行细胞移植构建鱼类嵌合体研究方面,现有的成功报道均采用显微注射方法;在转基因海水鱼类研究中,显微注射也是最为常用的技术,本实验室在花鲈胚胎干细胞嵌合体构建和外源基因向花鲈胚胎的转移研究中取得的结果也充分证实,显微注射技术是开展海水鱼类细胞移植和转基因研究的首选技术。     

中国对虾上皮样细胞培养研究

１９８９年８月起进行了中国对虾上皮细胞的原代和传代细胞培养。对取自甲壳，步足等部位的对虾上皮组织培养研究，共培养６批，获得传代细胞１１株，其中１株传至２５代，传代细胞形态为梭形和下沉上皮细胞形态相似。生长率测定结果，第４天细胞增殖达高峰，倍增时间为４８．７２ｈ。     

对虾细胞培养的研究现状

对虾的细胞培养，是研究对虾不同学科和领域的重要工具之一，至今，国内外已有不关于对虾细胞培养的研究报道，本文综述了不同作者对不同对虾细胞原代培养的结果，比较了其培养方法和培养条件的异同；描述了研究尝试多种方法对原代细胞的传代培养，其中一些方法对对虾细胞系的建立起到了积极的作用，介绍了利用细胞培养技术在对虾不同领域的应用状况，尤其是对对虾病毒性疾病的研究方面应用较多。     

鱼类细胞培养技术研究进展

鱼类细胞培养技术是一种重要且有潜力的生物学研究技术手段和方法。随着生物技术的发展,越来越多的鱼类细胞系(株)被建立。鱼类细胞培养的具体方法因细胞种类而异,但是总体上有共同之处。作者针对鱼类细胞培养的发展现状、应用与特点、方法技术进行综述,并为鱼类细胞培养的发展前景作出展望。     

永生化尼罗罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定

为获得具有单一克隆特性的能稳定传代培养的罗非鱼巨噬细胞系,本研究从尼罗罗非鱼腹腔中分离纯化巨噬细胞,采用EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染,筛选单克隆细胞的方法建立了尼罗罗非鱼巨噬细胞系,并对其进行了EBV感染鉴定、电镜观察、端粒酶活性检测、致癌性评估、核型分析以及分子生物学鉴定。研究表明,EBV已整合到尼罗罗非鱼巨噬细胞中且稳定表达,经30代稳定传代,该细胞系仍维持较好的增殖状态;该细胞系表面不平滑,有明显的钝圆形突起和细长的伪足,表现为典型的巨噬细胞形态;端粒酶活性显著高于未经感染的巨噬细胞,而与He La细胞差异不显著,且该细胞系不具有致癌性,说明永生化细胞系构建成功。核型分析结果发现,该细胞系具有44条染色体,其核型公式为2 n=2 x=44=4 sm+17 st+1 t。PCR检测发现,该细胞系存在CD33和CD205的转录本,这些都是单核巨噬细胞的标志物,经18S r RNA检测证明该细胞系来自尼罗罗非鱼巨噬细胞。永生化尼罗罗非鱼巨噬细胞系已被成功建立,该细胞系为研究罗非鱼链球菌HSP70-肽疫苗的高保护率,以及罗非鱼的免疫防御机制提供了工具。     

斑点叉尾鮰病毒对几种淡水鱼类细胞系感染性的初步研究

To study the susceptibility of multiple fresh water fish cell lines to channel catfish virus （CCV） and to evaluate and assess potentially pernicious impact of CCV on several rare and important economic fish species in China. Five cell lines established from several fish species including grass carp fins （GCF）, epithelioma papulosum cyprini （ EPC）, white sturgeon spleen （ WSS - 2 ）, chinook salmon embryo （ CHSE - 214 ） and parental control channel catfish ovary （CCO） were tested and compared for their sensitivity to CCV infection. After virns infection, test cells were characterized by cell morphology, cytopathic effect （CPE） appearance time, and infectious virus titer. Our results indicated that all these cell lines were sensitive to CCV, but at varied levels. Comparative viral challenge assays revealed that, among these five fish cell lines, GCF exhibited to be the most sensitive one to CCV infection, and infectious viral particles produced in this cell line is significantly more than that generated from parental CCO cells. EPC cells were also highly susceptible to CCV infection with a similar level of viral production as compared to CCO. Experimental data showed that all the test five cell lines were susceptible to CCV and present study suggests that CCV can be a potential pathogen to infect gYass carp, Cyprinus carpio and other fresh water fishes.     

鳗鲡冠状病毒样病毒的细胞分离与培养

实验选用４种鱼类传代细胞，对首次发现的鳗鲡“狂游病”的病原－鳗鲡冠状病毒样病毒进行了细胞分离与培养。本研究在鲤上皮乳头状瘤细胞中复制了鳗鲡冠状病毒样病毒粒子，并经病毒细胞培养物的电镜负染和超薄切片法检查得到了证实。