H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定

为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。     

淡水养殖鱼类主要细菌性传染病快速诊断的研究——直接荧光抗体法检测6株鱼类致病菌

用６种淡水鱼常见致病菌制备了荧光抗体诊断液，经交叉染色及对照菌染色，表明具有较高的特异性，可直接用病鱼的内脏涂片对致病菌做出鉴定，具有直观、快速的特点，适用于鱼类细菌病的快速诊断及流行病学调查。     

淡水养殖鱼类主要细菌性传染病快速诊断的研究——用SPA-CoA检测16株鱼类致病菌

用富含Ａ蛋白的金黄色葡萄球菌国际标准株（ｃｏｗａｎｌ），分别标记１６株淡水鱼类致病菌高兔血清，制备ＳＰＡ诊断液，建立了检测这１６株致病菌的ＳＰＡ－ＣｏＡ。将待检病料经分离培养１６～１８ｈ进行检测，３ｍｉｎ内可判定结果，比玻片凝集试验的敏感性高２５～５０倍。经交叉和重复性试验表明，其特异性强、重复性好、操作简便，快速，无需特殊仪器。适用于基层鱼场对淡水鱼类主要病原菌的快速鉴定和流行病调查。并将１６株致病菌用１１种药物作药敏试验，为防治上述致病菌引起的鱼病提供依据     

LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD的制备及跨膜研究

为了研究促黄体激素释放激素(LHRH)介导的TAT蛋白核心肽PTD的跨膜作用,测定目的蛋白的转导效率,试验以pET28a-PTD-GFP质粒为模板,设计含LHRH基因序列的特异性PCR引物,经PCR扩增后双酶切,并克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒并在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,超声破碎后进行硫酸铵梯度沉淀,取上清液用Phenyl-HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱纯化,将纯化后的目的蛋白加到体外培养的HeLa细胞中,观察转导情况,分析目的蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:PCR扩增得到目的基因LHRH-PTD-GFP,并成功构建出重组质粒pET28a-LHRH-PTD-GFP,在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达出目的蛋白,经Phenyl-HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱成功纯化出目的蛋白,在荧光显微镜下HeLa细胞内显现明显的绿色荧光,经分析转导效率与目的蛋白浓度之间呈正相关,回归系数为0.096 6,决定系数(R~2)为0.937 8。说明LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD具有很好的跨膜特性,转导效率对目的蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着目的蛋白浓度的增加转导效率增大。     

母马生长激素细胞和催乳激素细胞的形态计测学研究

利用免疫组织化学和形态计测学的方法 ,观察了 1 8匹成熟雌性蒙古马的脑垂体前叶生长激素细胞和催乳激素细胞的数量和面积 ,同时利用放射免疫分析方法检测了这两种激素的血浆水平。结果表明 ,每个马脑垂体前叶中 ,生长激素细胞的平均数量为 6 .42× 1 8,每个细胞的平均面积为 82 .40μm2 ;催乳激素细胞的平均数量为 6 .0 7× 1 0 8,每个细胞的平均面积为 47.31μm2 。生长激素的血浆含量平均为 2 .84ng/ m L,但个体差异较大 ,变异系数高达 78.5 % ,催乳激素的血浆含量平均为 7.2 6 ng/ m L。本研究结果揭示 :母马脑垂体生长激素细胞和催乳激素细胞的数量和面积并不是决定母马这两种激素血中浓度的唯一重要因素 ;生长激素血中浓度上的个体差异 ,可能与其搏动性分泌形式有关     

免疫亲和层析纯化EGF-PE40

用PEG融合法建立了分泌抗EGF-PE40抗体的杂交瘤细胞株,并筛选了一杂交瘤细胞株D7.用此细胞株制备了高抗体含量的腹水,用辛酸-硫酸胺沉淀法纯化了抗体IgG,用ELISA法测定其与EGF-PE40的亲和常数2.24×109L/mol,并鉴定其亚类为IgG1.将纯化后的单抗IgG与CNBr活化的Sepharose 4B偶联,并用免疫亲和层析的方法纯化粗提物中的EGF-PE40,得到了大于80%的纯化率,且产物显示了良好的生物学活性,这为EGF-PE40的进一步纯化和大量生产提供了可能.     

细胞黏附分子1（ICAM-1）ScFv基因原核载体的构建及表达

应用PCR技术扩增ICAM-1ScFv基因,经纯化测序,得到约750bp的核苷酸片段,并构建了原核重组表达质粒pET20b-ICAM-1ScFv。将重组质粒转化至表达菌BL21（DE3）中,诱导后的SDS-PAGE分析显示,pET20b-ICAM-1ScFv表达量占菌体蛋白总量的18.4%。本试验将重组蛋白的表达条件进行优化,结果表明,ICAM-1ScFv蛋白在pET20b表达载体中的最佳表达条件为37℃诱导5h。     

DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的纯化及细胞特异性毒性

重组表达载体pET28a/DAB389(Gly4Ser)2-αMSH在BL21(DE3)中以可溶形式表达重组蛋白,依次通过硫酸铵盐析、离子交换层析、亲和层析纯化、脱盐得93.26%重组蛋白纯品;细胞活性测试结果表明,该重组毒素只对SP2/0、HeLa、A549、A375等4种癌细胞有杀伤作用,对DK、BHK正常细胞没有杀伤力;重组蛋白对SP2/0、HeLa、A549、A375细胞的IC50分别为:3.138、2.736、7.243、4.672 mg/L。     

对虾副粘病毒样病毒的细胞分离培养

选用鲤鱼上皮乳状瘤细胞（ＥＰＣ）和虹鳟肝细胞（Ｒ１），对新发现的对虾暴发流行病病原副粘病毒样病毒进行了细胞分离与培养。结果证实对虾副粘病毒样病毒可在这２种鱼类传代细胞中复制，其中ＥＰＣ培养的病毒粒子的滴度在１０８／ｍＬ以上。     

DAB389(Gly4Ser)2αMSH重组融合蛋白的构建及表达

利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有αMSH全序列和（Gly4Ser）2互补序列的基因作下游引物，以pET28a／DAB389（Gly4Set）2EFG为模板，PCR扩增DAB389（Gly4Ser）2αMSH基因片段，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和NcoⅠ酶切，并插入原核表达载体pET28a的相应位点，构建了重组表达载体pET28a／DABm（Gly4Ser）2αMSH，在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389（Gly4Ser）2αMSH，转化菌经IPTG、30C诱导5h，用SDS—PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS—PAGE表明，重组蛋白相对分子质量为45870，且表达量达菌体总蛋白量的29．2％。Western blot分析显示，重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合。成功构建表达了重组DABm（Gly4Ser）2αMSH的工程菌株，表达产物具有生物学活性。