大珠母贝（Pinctada maxima）金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质。MT在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用。本研究通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库，首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599bp，5’UTR（Untranslated Region）为75bp，3’UTR为296bp，开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）为228bp，编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富，达到29．3％；赖氨酸和甘氨酸含量也较高，均为9．3％；不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸；含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明，该序列具备金属硫蛋白的典型特征，是金属硫蛋白家族成员。     

大珠母贝(Pincatada maxima)金属硫蛋白cDNA 克隆与序列特征分析

金属硫蛋白(Metallothionenin,MT)是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质.MT在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用.本研究通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白(PmMT)全长cDNA序列.该序列全长599bp,5'UTR (Untranslated Region)为75bp,3'UTR为296 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为228bp,编码75个氨基酸.编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达到29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列.序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员.     

褶牡蛎金属硫蛋白基因的克隆及组织表达分析

金属硫蛋白是一类广泛存在于生物体中的低分子质量、富含半胱氨酸、高度诱导性的内源金属结合蛋白。采用RACE技术,首次获得了褶牡蛎金属硫蛋白基因的全长cDNA序列。该序列全长500bp,由长54bp的5′非翻译区,122bp的3′非翻译区和324bp的开放阅读框组成,共编码107个氨基酸。该蛋白序列中半胱氨酸含量丰富(28%),不含芳香族氨基酸,富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys结构,存在软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白特征序列,是金属硫蛋白家族成员。荧光定量PCR法,测定褶牡蛎体内3种组织(内脏团、鳃、外套膜)中金属硫蛋白mRNA组织特异性表达以及重金属(Cd~(2+)、Zn~(2+))慢毒胁迫效应。结果表明,金属硫蛋白mRNA在褶牡蛎内脏团中相对表达量最高;褶牡蛎内脏团金属硫蛋白mRNA表达量与重金属胁迫时间呈现出一定时间效应关系,从胁迫开始至7d表现为正调,而7~10d开始为负调,Cd~(2+)胁迫和Zn~(2+)联合Cd~(2+)胁迫下金属硫蛋白mRNA表达量显著增加,最大表达量为对照组的42.5倍(Cd),Zn~(2+)联合Cd~(2+)胁迫表现为拮抗作用。本试验结果为生产实践上在多种重金属污染下应用金属硫蛋白作为生物标志物监测水域污染状况,保护水生生态环境提供了依据。     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法，得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR），189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF），编码354个氨基酸，预测其蛋白质分子量约40．10kDa，等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对，结果表明，军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征，包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示，MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达，但表达量各有不同，其中较强的表达于头肾；中等程度表达于鳃、脾和肠；在心、脑和肌肉中表达较弱。     

日本鳗鲡脂肪酸去饱和酶和延长酶基因的克隆与分析

利用RT—PCR和RACE方法克隆得到日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏中控制高不饱和脂肪酸（highly unsaturated fatty acids，HUFA）合成的脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）和脂肪酸延长酶（fatty acid elongase，ELO）全长cDNA序列。结果表明，2456bp的FAD全长cDNA序列含长达1046bp的3’-UTR、75bp的5’-UTR和编码444个氨基酸的长1335bp的阅读框。编码的蛋白序列含有FAD全部的特征结构区，包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素h5结构域，与其他具有不同生活史鱼类的FAD氨基酸序列具有70．5％～77．5％的同源性；分析显示其在系统树中与溯河洄游鱼类的亲缘关系最近。克隆得到的ELO全长cDNA序列长1239bp，含有885bp的开放阅读框，编码294个氨基酸，该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构，与其他鱼类ELO氨基酸具有87．1％～88．8％的同源性；其在系统树中与北非鲶鱼（Clarias gariepinus）和斑马鱼亲缘关系较近。日本鳗鲡FAD和ELOcDNA全序列的获得为今后进一步研究其体内高不饱和脂肪酸合成途径及阐明该途径在不同鱼类中的分子进化机理奠定基础。     

罗非鱼谷胱甘肽过氧化物酶1基因的克隆与分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术,克隆了罗非鱼（Oreochromis niloticus）谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione pemxidasel,GPx1）基因完整的编码序列（complete coding sequence,CDS）。GPx1基因全长984bp,5’uTR56bp,CDS576bp,3’UTR352bp,PolyA20bp;第791—885位碱基（位于3’UTR）形成1个硒半胱氨酸插入序列（selenocysteine insertion sequence,SECIS）,协助174～176位密码子TGA（UGA）编码1个硒半胱氨酸（Sec）。GPx1包含191个氨基酸,分子量21．8kDa,等电点8．04,无信号肽和潜在的N．糖基化位点。蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白。序列比对显示,GPx1单体具有Sec、Trp、Gln和Asn构成的催化四联体。罗非鱼GPx1与其他脊椎动物GPx1相比较,核苷酸序列相似性为43．2％-58．2％,氨基酸序列相似性为58．1％～80．6％。进化分析显示,处在分类学上不同纲的脊椎动物GPx1分别占据了不同分支。利用Swiss-Model预测了罗非鱼GPx1的3D结构,序列分析显示,GPx1可以形成1个同源四聚体。     

编码美洲螯龙虾肽聚糖识别蛋白（PGRP）cDNA的电子克隆及其生物信息学分析

利用电子克隆方法,获得编码美洲螯龙虾（Homarus americanus）肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein , PGRP）的cDNA序列及相应的氨基酸序列;采用生物信息学方法对其进行基本理化性质、亲疏水性、信号肽、二级结构、细胞定位、三级结构等的分析。结果获得一段长920 bp的编码美洲螯龙虾PGRP的cDNA序列,包含一个长834 bp的开放阅读框,编码277个氨基酸;编码蛋白是含有信号肽的分泌蛋白,含有1个C端PGRP结构域,表明是一种PGRP;分析结果显示该蛋白与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）短型PGRP-SC2和PGRP-SD比较相似。     

仿刺参超氧化物歧化酶基因cDNA全序列的克隆及其特征分析

以仿刺参Apostichopus japonicus为材料,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法首次得到仿刺参MnSOD的全长cDNA。该全长cDNA大小为955bp,其中5′端非编码区67bp,3′端非编码区216bp,开放阅读框(ORF)672bp,在3′端有多聚腺苷酸信号序列ATTTA,并有polyA加尾,符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。MnSOD全长cDNA可编码223个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子质量为24.64kD,理论等电点是6.66,为亲水性蛋白。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,仅有一段线粒体导肽。其二级结构主要以α-螺旋为主,无规则卷曲和延伸链构成了蛋白中量最大的结构元件,不含β-折叠。仿刺参SOD的氨基酸序列与目前已报道的其他物种如人、牛、斑马鱼、原鸡、非洲爪蟾、中国对虾、皱纹盘鲍、海湾扇贝、果蝇等的MnSOD氨基酸序列进行序列比对的结果表明,相似性均在61%～69%之间,说明该基因在各物种间具有一定的保守性。该段氨基酸序列无N-糖基化位点,含有3个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个肉豆蔻酰基化位点,还发现了1个SOD家族的特征肽段DVWEHAYY。对磷...     

稀有■鲫Foxo3a、Foxo3b基因克隆和表达分析

利用RACE技术自稀有■鲫的卵巢中克隆叉头蛋白O3a(Foxo3a）、叉头蛋白O3b(Foxo3b）基因的全长cDNA序列，采用RT-PCR、qRT-PCR和原位杂交法检测其组织分布、时序表达、细胞定位和雷帕霉素处理后的表达。结果显示，Foxo3a基因全长cDNA序列为2562bp，包括242bp的5′端非编码区、367bp的3′端非编码区、1953bp的开放阅读框，编码650个氨基酸；Foxo3b基因全长cDNA序列为2804bp，包括470bp的5′端非编码区、375bp的3′端非编码区、1959bp的开放阅读框，编码652个氨基酸。Foxo3a基因只在脑和卵巢中表达，在其他组织中不表达；Foxo3b基因在所检测的组织中均有表达，在脑和卵巢中的表达量较高。随着卵巢的发育，Foxo3a基因表达量呈逐渐升高的趋势，Foxo3b基因表达量未出现显著变化。原位杂交结果显示，Foxo3a、Foxo3b基因定位于卵巢Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时相的生殖细胞和滤泡细胞中。雷帕霉素处理影响了卵巢中Foxo3a基因的表达，对Foxo3b基因的表达无显著影响。试验结果表明，Foxo3a和Foxo3b基因可能在稀有■鲫...     

刺参vasa-1ike基因克隆及其在组织中的表达分析

vasa基因编码DEAD-box家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶，在生殖系分化过程中发挥着重要的作用。本研究采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术（RACE），从刺参（Apostichopus japonicus）精巢中克隆得到vasa的全长cDNA序列。该cDNA序列全长2167bp，开放阅读框1593bp，编码530个氨基酸，具有DEAD-box家族蛋白的全部9个保守域。经同源比对和系统进化分析，确定其属于DEAD-box家族的VASA亚家族成员。利用半定量RT-PCR检测，vasa mRNA专一性的在刺参性腺中表达，据此，刺参vasa基因有望用于其生殖系起源和分化的研究。[中国水产科学，2008，15（3）：407-413]     

文蛤生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因克隆、时空表达及SNP位点筛查

为探索文蛤GRB2基因的结构和功能,本实验通过已构建的文蛤转录组文库,利用SMART RACE技术扩增得到了文蛤GRB2基因的cDNA全长序列,对其生物信息学、组织及发育阶段表达特征进行了分析,并利用直接测序方法在外显子中筛选SNP位点。结果显示,GRB2基因cDNA全长1791bp,开放阅读框669bp,编码223个氨基酸,蛋白由SH-SH2-SH3三个结构域组成;氨基酸序列比对发现,文蛤GRB2与泥蚶的同源性最高,达到65.6%,与脊椎动物的同源性都在60%以上,说明GRB2基因在进化过程中比较保守。qRT-PCR结果表明,GRB2在文蛤6个组织和10个发育时期中均有表达,但不同组织间的表达量并没有显著差异(P＞0.05);发育时期中的表达量呈现逐渐升高的趋势,在壳顶幼虫时期达到最高,之后表达量又有所降低。SNP位点的筛选结果表明,在GRB2基因的外显子区域共发现16个SNP位点。     

文蛤转录组中微卫星位点生物信息分析#br#

采用生物信息学方法分析了文蛤(Meretrix meretrix)转录组中微卫星序列(简单重复序列,simple sequence repeat)的分布规律。结果表明:在文蛤转录组SSR中,单碱基重复序列的数量最多,有3001个;其次为三碱基和四碱基重复序列,分别为2254和2200个;二碱基重复序列1052个;五碱基重复序列332个;六碱基重复序列最少,仅13个。文蛤转录组SSR共包含26种重复基元,其中优势基元为单碱基重复A/T有2809个,其次为三碱基重复AAC/TTG有907个,四碱基和二碱基重复中的AAAC/TTTG和AT/TA分别有588和561个,说明文蛤转录组微卫星位点的分布对A/T具有偏好性。文蛤完整SSR的平均长度为18.34 bp,长度分布在12~20 bp,约占41%。研究结果将为研究文蛤SSR标记开发、群体遗传多样性、遗传连锁图谱、种质资源鉴定和分子遗传育种等后续研究提供基础数据。     

缢蛏ScHsc70 cDNA的分子特性和表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)cDNA文库中筛选出一条热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)同源序列,采用EST扩增和5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增方法获得全长cDNA序列,共2 335 bp,包括76 bp的5′非翻译区和309 bp的3′非翻译区,以及1 950 bp的开放阅读框。阅读框共编码649个氨基酸,推算的分子量约为70.89 kD,理论等电点为5.28。氨基酸序列分析结果表明,该基因的氨基酸序列含有HSP70家族的3个签名序列,2个糖基化位点,1个ATP-GTP结合位点,且C末端具有GGXP四肽重复序列以及细胞质特异性调控基序EEVD。该基因是组成型HSC70(Heat shock cognate 70)亚家族基因成员,被命名为ScHsc70。基于氨基酸序列的双壳贝类聚类分析表明,缢蛏与南极帽贝(Laternula elliptica)、文蛤(Meretrix meretrix)的亲缘关系最近。荧光定量表达分析显示,ScHsc70 mRNA在缢蛏水管、鳃、斧足、外套膜、肝和性腺等组织中以不同水平存在,其中在外套膜中的表达量最低,而在水管和肝中的表达量最高。经副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和副鳗弧菌(V.anguillarum)诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝中的水平呈现先升高后下降的变化趋势,且分别在感染后的第20小时和第30小时达到最高。结果提示,缢蛏ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。     

文蛤粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因克隆及与壳色性状的相关性分析

粪卟啉原Ⅲ氧化酶(coproporphyrinogen-III oxidase,CPOX)是卟啉类化合物合成过程中的关键酶,而卟啉是形成机体色素的重要化合物。采用RACE方法克隆获得文蛤粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因(MmCPOX)的cDNA序列,该序列全长1490 bp,其中开放阅读框1173 bp,编码390个氨基酸,预测分子量为12.04 ku,理论等电点为5.05;预测该酶含有跨膜结构域和Coprogen-oxidas结构域;从构建的系统进化树来看,软体动物门的文蛤、加州海兔和太平洋牡蛎首先聚在一起,显示出较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,MmCPOX基因在文蛤早期发育的各个时期均有表达,但在D形幼虫期以后表达量显著升高;在文蛤成贝的7个组织中,外套膜和血液中表达量显著高于其他组织,表明其与血卟啉合成和壳色卟啉形成相关;在不同壳色文蛤中,红壳文蛤、暗纹文蛤、细纹文蛤的外套膜中表达量显著高于黑斑文蛤和白壳文蛤,表明其参与形成红色和褐色壳色。     

文蛤30个微卫星标记的开发及在斧文蛤和帘文蛤

利用磁珠富集法构建的基因组文库和EST文库开发了30个文蛤多态性微卫星标记。8个G-SSR和22个EST-SSR多态性位点共获得140个等位基因,平均等位基因数为4.67,多态性信息含量、观测杂合度、期望杂合度分别介于0.172~0.744、0.040~0.720、0.187~0.793之间;G-SSRs的平均等位基因数、平均多态性信息含量、平均观测杂合度和平均期望杂合度都较EST-SSRs高;Hardy-Weinberg平衡检测发现,24个位点偏离了平衡状态;利用BLASTx对含多态性SSR位点的EST进行功能注释,11个位点来自注释基因序列。 将30对文蛤多态性SSR引物分别在斧文蛤和帘文蛤中进行了通用性检测,通用率分别为30%和40%。这些微卫星多态性位点的获得,为进一步开展文蛤遗传多样性分析、种质资源评价、分子标记辅助选育等奠定基础,并且可用于文蛤、斧文蛤和帘文蛤的比较作图、基因发掘和QTL定位等研究。     

文蛤生物活性多肽/蛋白研究进展

文蛤(Meretrix meretrix)是一种重要的海洋贝类,其肉质鲜美、营养丰富,含有多种人体必需氨基酸、微量元素、维生素和其它活性物质。研究发现,文蛤多肽、蛋白和酶具有多种生物功能,如免疫调节、抗氧化、抗菌、消炎、抗脂质、抗衰老、降血糖活性、抗高血压和红细胞凝集活性及预防癌症、肝损伤保护作用。总结了文蛤生物活性多肽、蛋白质、酶及酶抑制剂的最新研究进展,并对下一步研究方向进行了展望,旨在为文蛤活性多肽/蛋白利用的深入研究提供参考。     

文蛤病原菌——需钠弧菌的鉴定和生物学特性分析

从患病文蛤Meretrix meretrix体内分离出一优势菌株WT01，回归感染试验证明是文蛤的致病菌。对该菌形态、生理生化特征、盐度、温度和PH值生长条件以及16S rRNA基因序列进行了研究。结果表明，该菌为革兰氏阴性菌，发酵葡萄糖产酸不产气，氧化酶阳性，生长需NaCl，无色素，不发光，在TCBS平板上形成圆形黄色菌落，对弧菌抑制剂O／129敏感，具有弧菌属的典型特征。16S rRNA基因序列分析表明，该菌与需钠弧菌Vibrio natriegen的亲缘关系最为接近，其同源性达999／6以上。因此，将该菌鉴定为需钠弧菌。实验显示其半数致死量为5．5×10^6CFU／g。19种抗菌药物药敏试验结果表明，该菌对氟哌酸、复方新诺明、菌必治、先锋必、链霉素、氯霉素和庆大霉素等抗生素较为敏感。并对其胞外产物的生物学特性进行了分析。     

我国沿海不同群体文蛤遗传差异RAPD分析

本文运用RAPD对辽宁、山东、江苏、福建、广东、广西等7个地理群体的文蛤进行了分析。从40条随机引物中,筛选出11个扩增效果好、条带清晰的随机引物进行扩增。结果显示,7群体内遗传多样性丰富,遗传相似度在0.7251~0.8972之间,依次排列为:辽宁营口(0.8972)>广东湛江(0.8756)>山东日照(0.8729)>山东潍坊(0.8643)>福建云霄(0.8245)>江苏启东(0.7653)>广西合浦(0.7251)。群体间遗传距离指数及用UPGMA和NJ法构建的分子系统树结果表明,山东日照与山东潍坊两群体的亲缘关系较近,广东湛江群体与其它群体亲缘关系相对较远。     

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。     

文蛤肠、外套膜和肝胰脏组织 cDNA 文库构建及其 ESTs 序列分析

利用SMART cDNA文库构建试剂盒构建了文蛤(Meretrix meretrix)肠、外套膜和肝胰脏组织的cDNA文库。经测定原始文库滴度分别为2.10×106、1.70×106和1.60×106,重组率高于95%,肠组织文库插入片段长度均大于1000bp,外套膜和肝胰脏组织文库的插入片段长度大于1kb的占87.5%,文库质量符合标准要求。随机选取文库的3168个克隆进行5′端测序,获得高质量表达序列标签(Expressed Sequence Tags,ESTs)3029个(肠:1005,外套膜:1019,肝胰脏:1005),测序成功率95.58%。经质量控制和拼接得到1796个单基因簇(Unigene),其中306个叠联群(Contigs),1490个单一序列(Singletons)。通过Blastx搜索比对、查询和注释分析,共得到已知基因696个(肠:216,外套膜:235个;肝胰脏:245个),占总数38.75%。在1796个单基因簇(Unigene)发现微卫星序列55条,这些存在微卫星位点的序列占整个ESTs数据库的3.1%。