高效液相色谱-串联质谱法检测3种渔业环境基质中的孔雀石绿及隐性孔雀石绿残留

为了准确评估渔业生态环境中的孔雀石绿(MG)及其代谢产物隐性孔雀石绿(LMG)的残留状况,建立了3种渔业环境基质(水体、底泥和底泥-水体混合物)中MG和LMG的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。通过考察不同前处理方法对不同基质中MG和LMG回收率的影响,优化仪器性能,确定了色谱和质谱分析条件。具体方法是:水体过滤后采用PRS固相萃取柱进行净化、富集;底泥采用乙腈-二氯甲烷(1∶1,v/v)提取,再旋蒸、富集;底泥-水体混合物用二氯甲烷提取后,采用PRS固相萃取柱净化、富集。采用Thermo C18色谱柱对待测物进行分离,以乙腈-0. 2%乙酸铵(1∶1,v/v)为流动相洗脱,电喷雾-多反应正离子监测模式监测,内标法定量。结果表明,3种不同基质中的MG和LMG在1～8 ng/m L范围内线性显著,其相关系数r~2值大于0. 999;加标回收率分别为90. 0%～104. 2%、79. 9%～90. 3%和74. 1%～86. 3%,相对标准偏差为3. 3%～5. 8%、4. 9%～8. 6%和3. 2%～8. 3%; MG的检出限(LOD,S/N=3)分别为0. 24 ng/L、0. 02μg/kg和0. 06μg/kg,定量限(LOQ,S/N=10)分别为0. 79 ng/L、0. 07μg/kg和0. 21μg/kg; LMG的检出限(LOD,S/N=3)分别为1. 14 ng/L、0. 17μg/kg和0. 12μg/kg,定量限(LOQ,S/N=10)分别为4. 72 ng/L、0. 56μg/kg和0. 39μg/kg。该法可应用于渔业环境中MG及LMG的定性定量检测,具有较好的实用性。     

液质质串联质谱法测定淡水及沉积物中硝基呋喃类代谢物

改进了淡水水体和沉积物中4种硝基呋喃代谢物呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃妥因代谢物(AHD)、呋喃西林代谢物(SEM)的高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法。方法采用内标法定量,提高了定量的准确性。水及沉积物样品直接进行衍生化后乙酸乙酯提取,化合物采用Thermo C18(5.0μm,100mm×2.1mm)色谱柱进行分离,以0.1%甲酸/甲醇-5mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱。方法的线性范围为0.1~200ng/mL,r2≥0.999。空白水体在0.02、1.0、10.0ng/L 3个加标水平下的平均回收率为75.4%~82.7%,相对标准偏差(RSD)为3.2%~8.7%,检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为0.01ng/mL和0.02ng/mL。沉积物样品在0.3、1.0、10μg/kg 3个加标水平下,平均回收率为77.9%~93.6%,RSD为2.5%~7.8%,检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为0.1μg/kg和0.3μg/kg。该方法灵敏度高、选择性好,适用于实际淡水养殖环境水体和底泥中4种硝基呋喃代谢物呋喃唑酮代谢物的残留测定。     

孔雀石绿及其主要代谢产物在欧洲鳗鲡体内的蓄积及消除规律

为了解孔雀石绿及其有毒代谢产物无色孔雀石绿在鱼体中的蓄积与消除规律,达到对孔雀石绿的禁用监控,本试验对初始体重为12.42±2.18 g的欧洲鳗鲡进行0.1 mg/L药浴24 h,再转移到清水中养殖120d,采用高效液相色谱法测定血液、肝脏、肾脏和肌肉组织中孔雀石绿(MG)及其代谢物无色孔雀石绿(LMG)的残留。结果表明:在药浴开始阶段,肝脏、肾脏和肌肉中的MG含量迅速上升,肝脏、肾脏和血液于浸浴6 h时即达到最高平均值,分别为859.8±127.0μg/kg、589.2±40.0μg/kg和88.6±51.3μg/kg,肌肉于浸浴12h时达最高值(720.5±192.6μg/kg),随后含量下降。鳗鲡各组织中LMG高峰出现时间都晚于MG,血液、肝脏和肾脏中的LMG都是在浸浴12 h时,达到最高平均值,分别为1 135.0±376.4μg/kg、1 730.9±538.5μg/kg和238.9±105.5μg/kg;肌肉组织LMG的高峰出现时间更晚,是清水养殖3 d(72 h)时,为960.1±251.0μg/kg。血液中的MG消除最快,于清水养殖的第2天(48 h)检测不到残留。肾脏于养殖10 d(240 h)、肝脏于养殖45 d(1 080 h)时检测不到残留MG,而肌肉中的MG在养殖90 d时才检测不到。LMG在鳗鲡血液和肌肉组织中消除时间与MG相比显著延长,血液中的LMG消除时间是养殖90 d(2 160 h),而肌肉中于养殖120 d时,仍能检测到一定含量的LMG。除了肾组织在整个试验阶段和肌肉组织在浸浴过程中,所含平均MG比LMG高以外,其余情况下都是LMG平均含量明显高于MG平均值。本试验表明,可以通过对鳗鲡肌肉中的无色孔雀石绿残留的检测达到对孔雀石绿禁用的监控。     

阳性养殖环境中鳜体内孔雀石绿及其代谢物残留消除规律

建立了QuECHERS结合UPLC-MS/MS快速测定鳜体内孔雀石绿(MG)及其代谢物残留量的方法,该方法在0.1～100.0 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好,相关系数r大于0.999 8, MG和隐色孔雀石绿(LMG)在鳜肌肉中的检出限(Limit of detection, LOD)和定量限(Limit of quantitation, LOQ)分别为0.10和0.30μg/kg。在添加水平分别为0.30、1.50和5.00μg/kg条件下,鳜肌肉中MG和LMG平均回收率范围分别为(96.40±5.34)%～(104.00±1.75)%和(92.40±2.54)%～(107.00±8.42)%,精密度范围分别为1.68%～5.54%和2.75%～7.87%,回收率和精密度均符合残留检测要求。采用本研究建立的残留分析方法研究了阳性养殖环境中鳜体内MG和LMG残留消除规律,结果表明,阳性养殖环境中[沉积物中MG和LMG残留量为(233.48±17.07)μg/kg和(73.38±5.98)μg/kg],鳜体内MG残留以LMG为主,其残留含量均在10.0μg/kg以下,LMG呈现先增加后降低的趋势且消除较慢,10 d时达到最高含量(9.94μg/kg),随后呈波动式下降,直至240 d时未检出。推断若阳性养殖环境中残留MG或LMG则会造成鳜体内LMG长时间残留,易对鳜食用安全性造成隐患。为了保障鳜的食用安全性,建议对鳜养殖环境中MG和LMG残留量进行测定,确保养殖环境中无MG和LMG残留,并适当延长养殖周期。     

LMG在养殖水体中的残留及其在鱼肌肉中的积累

检测曾投放过孔雀石绿(MG)养殖池塘中水样MG和隐性孔雀石绿(LMG)含量,并以此数据为基础通过室内模拟实验研究了不同浓度LMG养殖水体中生长的罗非鱼(Tilapia)和淡水白鲳(Colussoma brachypomum)肌肉中的积累情况。结果显示:所选取的5个池塘中LMG平均含量为30.32 ng/mL,6个月前使用过孔雀石绿的5个鱼塘的养殖水体中仍有一定量LMG残留。室内模拟实验显示:在LMG初始浓度为1.00 ng/mL的养殖水体中,LMG在罗非鱼和淡水白鲳肌肉中积累浓度分别高达60.0 ng/g和70.8 ng/g;罗非鱼肌肉中脂肪含量为0.53%,淡水白鲳为0.75%,说明脂肪含量高的淡水白鲳更容易积累LMG。同时发现,罗非鱼和淡水白鲳积累LMG浓度与水体中LMG浓度成正相关。     

QuEChERS-UPLC-MS/MS法测定水产品中孔雀石绿和酰胺醇类抗生素残留量

建立了超高效液相色谱质谱联用法同时测定水产品肌肉组织中孔雀石绿和酰胺醇类抗生素残留的方法。样品经QuEChERS方法提取净化后,采用液相色谱-串联质谱测定,内标法定量。孔雀石绿(malachite green,MG)、隐色孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)、氯霉素(chloramphenicol,CAP)和氟甲砜霉素(florfenicol,FF)在0.5～50.0 ng/mL质量浓度范围内线性良好(r≥0.999 4)。甲砜霉素(thiamphenicol,TAP)在2.0～100.0 ng/mL质量浓度范围内线性良好(r≥0.999 6)。MG、LMG、CAP和FF的检出限为0.1μg/kg,定量限为0.5μg/kg;TAP的检出限为0.4μg/kg,定量限为2.0μg/kg。MG、LMG、CAP和FF在0.5、2.0和10.0μg/kg加标水平时,加标回收率为72.0%～102.6%,精密度小于6.4%;TAP在2.0、10.0和50.0μg/kg加标水平时,其加标回收率为76.5%～95.4%,精密度小于5.1%。本方法适用于检测水产品中孔雀石绿类和酰胺醇类抗生素的残留,可为提升水产品质量安全水平提供技术支持。[中国渔业质量与标准,2020,10(1):60-67]     

孔雀石绿及其代谢物在斑点叉尾体内及养殖环境中的消解规律

研究了以全池泼洒的投药方式,孔雀石绿(MG)(池塘中MG的理论浓度为1 mg/L)及其主要代谢物隐性孔雀石绿(LMG)在斑点叉尾(Ietalurus punetaus)肌肉和皮肤以及养殖水体和底泥中的残留消除规律。采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析MG及其代谢物LMG在斑点叉尾体内及环境中的浓度水平。结果显示:肌肉、皮肤中MG于用药后第1天最高浓度分别为:(42.77±5.26)μg/kg和(6.36±0.11)μg/kg,消除半衰期T1/2分别为57.76 d、31.51 d;皮肤和肌肉中LMG分别在用药后第3天和第1天达到最高(502.27±20.43)μg/kg和(125.26±12.76)μg/kg,消除半衰期T1/2分别为33.01 d、38.51 d。这表明MG在斑点叉尾体内会迅速转化为LMG,且LMG残留在皮肤中的浓度大于肌肉中的浓度。养殖环境底泥中同时存在MG和LMG,以LMG为主,并且LMG呈现蓄积的趋势,在第360天出现最高浓度(5.92±1.23)μg/kg;水体中MG最高浓度出现在第1天,为(46.44±7.39)μg/L,随后急剧降至1μg/L左右,水体中几乎不存在LMG。     

QuEChERS结合HPLC-MS-MS测定鲮体内孔雀石绿及其代谢物残留及消除规律

通过对干燥剂、分散吸附剂的种类及质量进行对比及优化,对鲮体内孔雀石绿(MG)及其代谢物的分散固相萃取/高效液相色谱-串联质谱(Qu ECh ERS-HPLC-MS/MS)联用方法进行了优化。方法以乙腈为萃取溶剂,无水硫酸镁为干燥剂,乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)与石墨化炭黑(GCB)为分散吸附剂,电喷雾正离子模式(ESI+),多反应监测模式,内标法定量。结果显示,无水硫酸镁对样品中水分干燥效果良好,50 mg PSA+10 mg GCB可达到净化效果。在优化条件下,MG和无色孔雀石绿(LMG)在1~50 ng/m L范围内呈现良好的线性相关,相关系数r分别为0.999 21和0.999 37;方法检测限(LOD,S/N=3)为0.5μg/kg。采用该方法对鲮空白样品进行检测及加标回收率的测定,在2.0、10、25μg/kg 3个浓度水平下,MG的加标回收率为82.5%~92.6%,LMG的加标回收率为84.6%~95.1%。将该方法用于鲮体内MG及LMG残留消除规律研究,得到MG和LMG的消除半衰期分别为13.6、178.3 h,表明MG在鲮体内消除相对较快,但是其主要代谢产物LMG消除缓慢,直到40 d后低于检测限。本研究可为鲮等水产品中MG和LMG的检测提供支持技术,为水产品质量安全监管提供参考数据。     

孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿在鲫鱼组织中的分布及消除情况研究

以0.5 ppm的孔雀石绿浸泡3天再清水养殖的鲫鱼为研究对象,研究孔雀石绿(MG)及其代谢物隐性孔雀石绿(LMG)在鲫鱼肌肉及各组织中的分布及消除情况.在浸泡结束后的第0、7、14、21天,分别取鲫鱼肌肉、肾脏、肝胰脏、脾脏、血液、性器官,采用高效液相质谱法检测孔雀石绿及隐性孔雀石绿的浓度水平,并分析其在各组织中的分布情况及消除规律.结果表明,在浸泡结束后的第0天,孔雀石绿及隐性孔雀石绿主要蓄积在肌肉和肾脏,其孔雀石绿浓度分别为1043.86μg/kg、1618.05μg/kg;隐性孔雀石绿浓度分别为1650.62μg/kg、1228.32μg/kg.随着清水养殖实验的进行,孔雀石绿及隐性孔雀石绿在鲫鱼各组织中逐渐消除,到21天,肾脏、脾脏、肝胰脏、血液中均没有检测到药物残留,而肌肉和性器官中仍然检测到残留,孔雀石绿浓度分别为6.16μg/kg、3.3μg/kg;隐性孔雀石绿浓度分别为11.13μg/kg、5.49μg/kg.清水养殖21天,孔雀石绿及隐性孔雀石绿在肌肉中的消除率分别是99.4%、99.3%;在性器官中的消除率分别是90.8%、98.7%.     

药浴条件下孔雀石绿及无色孔雀石绿在鳜体内的残留及消除规律

为了解孔雀石绿(MG)及无色孔雀石绿(LMG)在鳜体内的残留和消除规律,达到对MG的禁用监控,本实验将初始体质量为(15±5)g的鳜在1 000μg/L孔雀石绿中药浴1 min后,再转移到清水中养殖,采用液相色谱串联质谱法测定鳜肌肉组织中MG及LMG的残留量。清水养殖过程中,在0~6 h范围内,肌肉中MG的残留量急剧下降,到12 h降为(5.42±4.32)μg/kg。从12~30 h范围内MG的残留量呈现上升趋势,而随后逐渐降低,到240 h后残留量低于检测限(0.5μg/kg)。LMG在0~30 h范围内随时间波动式上升到(56.54±4.82)μg/kg。在30~72 h范围内LMG的残留量急剧下降至(3.40±6.82)μg/kg,而随后缓慢下降,到960 h后残留量低于检测限(0.5μg/kg)。本研究可为加强MG的监督和执法管理工作提供参考依据,为水产品质量安全风险评估提供技术支撑。     

用紫外和荧光检测器同时分析水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的高效液相色谱法

建立了用紫外和荧光检测器同时分析水产品中有色孔雀石绿和无色孔雀石绿的高效液相色谱法。有色孔雀石绿检测采用紫外检测器,波长588 nm;无色孔雀石绿采用荧光检测器,其激发波长265 nm,发射波长360 nm,流动相0.1 mol/L(pH4.5)的乙酸铵溶液∶乙腈(20∶80),流速1.5 ml/min。采用ZOBAX C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱。加标量为10μg/kg和250μg/kg(有色孔雀石绿),回收率分别为60.2%和56.6%,相对标准偏差分别为10.1%和5.6%;加标量为2μg/kg和50μg/kg(无色孔雀石绿)时,回收率分别为95.2%和92.3%,相对标准偏差分别为10.8%和11.3%。该方法的最低检测限1.1μg/kg(孔雀石绿和无色孔雀石绿总量),可满足欧盟对水产品中孔雀石绿的检测要求。检测方法稳定,简便,灵敏度高,无需柱后氧化柱,适合同时进行水产品中有色孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的检测。     

液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中阿维菌素、伊维菌素及四种三苯甲烷类残留

建立了液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)同时测定水产品中阿维菌素(AVM)、伊维菌素(IVM)及四种三苯甲烷类(孔雀石绿MG、结晶紫CV、隐性孔雀石绿LMG和隐性结晶紫LCV)残留的分析方法。样品中加入内标物,经乙腈提取,中性氧化铝固相萃取柱净化,净化后溶液用HPLC-MS分析,采用试剂线性曲线,AVM和IVM采用外标法,三苯甲烷类采用内标法定量。AVM和IVM在2.0～80μg/kg浓度内具有良好的线性关系;四种三苯甲烷类在0.25μg/kg～10μg/kg浓度内具有良好的线性关系。最低检出限分别为4.0μg/kg和0.5μg/kg,加标回收率在89.8%～113%之间,相对标准偏差(n=6)在1.4%～10%之间。     

模拟运输条件下孔雀石绿及其代谢物在鳜体内的残留消除规律

在模拟运输条件下,分析孔雀石绿(MG)及其代谢产物隐色孔雀石绿(LMG)在鳜体内的代谢规律。将体重为(20±5)g的健康鳜放入100μg/L MG药液中,分别药浴5 min、1 d和2 d后,于药浴后取样检测,发现鳜体内MG和LMG残留量随药浴时间增加而增加,药浴2 d的鳜在药浴后90 d仍有MG和LMG残留。采用100、200和400μg/L MG药浴2 d后,鳜体内LMG药峰浓度C_(max)分别为658.37、1 128.80和1 461.25μg/kg,鳜体内LMG的富集量随药浴浓度的增加而增加;400μg/L MG溶液药浴下鳜体内MG和LMG消除半衰期T_(1/2)分别为64.39和42.69 d,表观分布容积V_d为21.55和0.98 L/kg,清除率CL分别为0.232和0.016 L/d,体内平均驻留时间MRT分别为81.05和49.43 d。本研究结果表明,在运输条件下鳜体内MG和LMG消解较慢,易造成鳜中MG和LMG超标,建议加强鳜运输环节中MG的监管,确保鳜等水产品的质量安全。     

超声波一步提取淡水鱼氯霉素药残检测的方法初探

尝试前处理采用超声波一步提取淡水鱼氯霉素药物残留并液相串联质谱仪检测的方法,相比于GB/T 20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》前处理步骤相对简单、快速,采用内标法定量,选用鲢鱼为空白,添加0.1μg/kg、0.3μg/kg,回收率在90%~120%,在0.1~2.0ng/mL范围内线性关系良好,R20.999,相对标准偏差(RSD)9%,满足GB/T20756-2006和GB/T 27404-2008对准确度和精密度的要求。通过计算得到理论方法检出限(LOD)为0.002μg/kg,理论方法定量限(LOQ)为0.008μg/kg。     

鱼配合饲料中氯霉素残留量的检测方法

研究了一种相比于GB/T 21108-2007《饲料中氯霉素的测定高效液相色谱串联质谱法》前处理步骤相对简单的方法测定鱼配合饲料,采用内标法定量,添加0.1μg/kg、0.3μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg四个浓度,回收率在90.2%~119.9%。氯霉素在0.1~20.0ng/mL范围内线性关系良好,R20.999,相对标准偏差(RSD)6%,满足GB/T 27404-2008以及GB/T 21108-2007对回收率和精密度的所有要求。通过计算得到方法检出限(LOD)为0.002μg/kg,方法定量限(LOQ)为0.006μg/kg。     

同位素内标法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物

建立了水产品中孔雀石绿、结晶紫及代谢物无色孔雀石绿、无色结晶紫的液相色谱—串联质谱测定方法。以氘代孔雀石绿、氘代结晶紫、氘代无色孔雀石绿、氘代无色结晶紫分别为孔雀石绿、结晶紫、无色孔雀石绿、无色结晶紫的同位素内标进行定量,4种化合物的质量浓度为0.5～10.0μg/L时线性关系良好(r2≥0.9992);在0.5、0.75、1.0μg/kg 3个质量浓度水平添加,平均回收率为101.4%～114.6%,相对标准偏差均小于7.0%。     

不同冷冻贮藏时间对三种鱼类肌肉中孔雀石绿残留量的影响

研究鲤鱼、鳗鲡、鳜鱼在加入不同浓度的孔雀石绿标准样品且在不同冷冻贮藏时间下对孔雀石绿残留量的影响。三种基质中,鳗鲡组织中添加有无色孔雀石绿降解速率最慢、鳜鱼次之、鲤鱼较快。三种基质中添加10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg有色孔雀石绿平均降解率分别为57.9%、48.0%、23.0%;无色孔雀石绿平均降解率分别为46.6%、43.4%、19.8%,有色孔雀石绿较无色孔雀石绿降解快,低浓度较高浓度降解快。在三种基质鲤鱼、鳗鲡、鳜鱼组织中有色和无色孔雀石绿降解反应均符合准一级反应动力学。分析可能由于鳗鲡组织脂肪较多,其结合方式影响了有色无色孔雀石绿的降解。     

功能性电极快速伏安检测孔雀石绿

用阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)修饰导电炭黑糊电极,制备了对孔雀石绿(MG)具有高灵敏度的功能传感器。实验对MG在该功能电极上的电化学行为进行了研究,并对影响测定的各种条件(制备糊电极所用导电材料种类;功能试剂修饰量;支持电解质的离子强度、pH值、种类;富集电位与时间等)进行了优化。在优化条件下,MG的氧化峰电流(ipa)与其浓度在5～200μg/L范围内呈线性关系,检测限为1.5μg/L(S/N=3)。该方法具有较高的灵敏度、良好的重现性和稳定性。应用于测定经过简单过滤预处理后的淡水渔业水样,平均回收率为90%。     

阳性饵料鱼投喂模式下孔雀石绿及代谢物无色孔雀石绿在鳜体内的残留消除规律

为了解鳜(Siniperca chuatsi)食用含有孔雀石绿(malachite green,MG)的饵料鱼后,其体内MG及其代谢物无色孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)的残留消除规律,以期为孔雀石绿的监管提供基础数据,本实验模拟了自然养殖条件,对饲养于池塘网箱中的鳜连续投喂10 d经1 mg/L MG溶液浸泡2 min后的鲮(Cirrhinus molitorella),投喂量为5%(m/m),于停药后0、6、12 h及1、3、6、10、15、20、30、40、50、70、90、120、150和180 d采集鳜肌肉样品,各采集点随机取6尾以上鳜,采用液相色谱串联质谱法测定鳜肌肉中MG和LMG的残留量。结果发现,阳性饵料鱼投喂结束后,鳜体内未检出MG,LMG残留浓度也较低,在0 h鳜肌肉中LMG的浓度为8.62μg/kg,随后缓慢降低,10 d时鳜肌肉中检测不到LMG。本研究表明,养殖过程中,阳性饵料鱼体内的MG会通过食物链传递给鳜,造成鳜体内LMG检出,建议执法部门对鳜的饵料鱼进行监控,以确保鳜的食用安全。     

超高效液相色谱-串联质谱快速测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量

建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定水产品中孔雀石绿（MG）、结晶紫（CV）及其代谢物隐色孔雀石绿（LMG）和隐色结晶紫（LCV）残留量的快速、准确检测方法。该法在SN/T1768-2006快速检测方法的基础上,采用空白样品添加不同质量浓度标准溶液的方式绘制校准曲线,并以氘代孔雀石绿（D5-MG）和氘代隐色孔雀石绿（D6-LMG）为内标进行检测,从而大大提高了定量的准确性。结果表明,MG、CV、LMG和LCV4种待测物在0～10.0ng·mL^-1范围内线性关系良好（R〉0.99）,方法检出限均为0.1μg·kg^-1。在加标量为0.5和1.0μg.kg-1水平下4种待测物平均回收率在92.1%～111.0%之间,测定结果的相对标准偏差为2.2%～9.5%。此外,该法在FAPAS国际能力验证中得以证实,改进后的方法快速且准确,能满足水产品出口检测要求。