光对海带雌、雄配子体 lhcf5 和 lhcf6 基因相对转录量的影响

利用实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)方法分析了在不同光照强度、光质及有利于配子产生的条件下,lhcf5和lhc6基因在海带(Laminaria japonica)雌、雄配子体中转录量的变化.不同光照强度条件下(光源为白光),lhcf5和lhcf6基因在黑暗中接近不转录;雌配子体在光照强度40 μmol·m-2·s-1时转录量最高,而雄配子体的最岛转录量出现在80μmol·m-2·s-1的光照强度处;高于此光照强度,2个基因的转录量都会随光照强度增加而降低.相对于同强度的白光来说,红光照射无论是短时间(3 d)还是长时间(7 d),都会促进2个基因的相对转录水平;蓝光对雌配子体中2个基因转录的促进作用不明显,而对它们在雄配子体中的转录有一定的促进作用.将海带配子体从营养生长转至有利于配子发生的条件下,雌、雄配子体lhcf5和lhcf6基因在第1天的转录最都明显增加;雌配子体在第4天以及第12天(lhcf6)或第14大(ljcf5)均显著增加,第6天及第10天接近不转录;雄配子体在第8天及第14天增加,第10天也近似不转录;发育阶段其他时间内的转录量都低于营养生长期的.结果表明,海带配子体lhcf5和lhcf6的转录受光诱导,其中红光的促进作用最明显;其转录可能因有利于配子体细胞叶绿体结构的完善及物质与能量的积累而利于细胞分裂与营养生长.     

海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表达

从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列,其中开放阅读框450 bp,5′-非翻译区182 bp,3′-非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾巴。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytB domaincontaining protein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulationrelated protein gene,srp)(GenBank登录号:EF490313)。然后构建了srp基因原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达,获得了分子量大小约19.3 ku的目的蛋白,且表达量与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相色谱-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与推测的目的蛋白一致。最后纯化重组了SRP蛋白并制备其多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实SRP蛋白的存在。     

海带配子体碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分析

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3′-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO₂浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO₂。     

海带cbbX基因序列特征及在雌、雄配子体之间的差异表达

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆了一条长2087bp的cDNA序列(GenBank登陆号:EF490312),其中开放阅读框1275bp,5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3′-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白(GenBank登录号:CAB65663)具有66%同源性。推测的海带配子体cbbX基因编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白,前19个氨基酸为信号肽序列。酶切后的成熟蛋白由405个氨基酸组成,分子量为45.26ku,等电点为5.28。海带配子体cbbX基因被8个内含子隔离开,它们的剪切位点都遵循GT-AG规则。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体cbbX基因都没有差异。自编码蛋白的第184位Gly开始,具有一个典型的Walker ATP-结合motif。通过与其它物种共14个CbbX蛋白序列...     

海带雄性配子体差异表达基因片段的克隆及筛选

利用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段，将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli）JM109，构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定，电泳图谱表明插入片段大小在200～1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后，选取10个阳性克隆进行测序和序列分析，有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性，初步判断为新的基因序列，3个片段与已知脚基因和Lhcf6基因的同源性分别达到88％和98％。     

孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减cDNA文库的构建及分析

利用抑制消减杂交技术构建了潮间带绿藻孔石莼(Ulva pertusa)在干出胁迫状态下上调表达基因的消减cDNA文库.获得的阳性克隆经测序得到150条上调表达的EST片段,其中21条为冗余序列(RS),137条非冗余序列(NRS).片段中最长833 bp,最短106 bp,平均长度364 bp.参与比对的EST片段按照...     

海带染色体的DAPI染色及核型初步分析

鉴于海带染色体比较小且数目存在分歧等原因,利用0.2%秋水仙素对海带配子体及孢子体处理10 h左右,经过卡诺试剂固定、多种酶组合处理及30 cm的高位滴片,可以获得质量比较高的海带染色体;使用灵敏度高、特异性强的DNA荧光染料DAPI进行染色,结果显示,海带雌、雄配子体的染色体各为31条,孢子体染色体为62条,大多为短杆状或者点状;雌配子体染色体的大小为0.78～2.61μm,稍大于雄配子体(大小为0.57～2.17μm)。根据染色体的大小,对海带配子体的染色体核型进行了初步分析。这些结果为分子标记的染色体定位等细胞学研究奠定了技术基础。     

重离子束辐射对海带配子体克隆的影响

利用~(12)C重离子束对东方海洋种质库保存的8个海带配子体克隆系进行3次辐射试验,辐射剂量分别为10、20、40、50、60、80、120、160、200和240 Gy。结果表明,使海带配子体克隆细胞发生变化的最低辐射剂量为60 Gy,随着剂量的增大,细胞死亡增多,240 Gy辐射剂量下仅有一个克隆系存活;80 Gy辐射剂量下细胞存活率约为50%～60%;不同海带配子体克隆系对重离子辐射的耐受度稍有差别;雄配子体比雌配子体耐受力稍强。     

鲤鱼和斑马鱼同义密码子使用偏性分析

本研究利用鲤鱼454测序所获得的基因的表达序列和GeneBank中斑马鱼全部基因的编码序列,采用多重变量分析软件CodonW对鲤鱼和斑马鱼影响密码子用法的因素进行了分析.结果表明,两个在59种同义密码子中有27种为最优密码子.伺时还指出,最优密码子的使用频率(Fop)与基因的G+C含量(GC),尤其是第三位密码子的G+C百分含量(GC3S)、密码子适应指数(CAI)和密码子偏爱指数(CBI)之间均呈现极显著的正相关(鲤鱼和斑马鱼的相关系数分别为r=0.4108和0.4087、0.5354和0.5628、0.7547和0.7771、0.9803和0.9741),而与有效等位基因数ENc存在显著负相关(相关系数r=-0.2832和-0.2390).表明基因GC含量直接影响密码子使用的偏性,同时基因的表达水平越高,对密码子的使用偏向性越强.     

盐度对笼目海带配子体生长发育的影响

通过设置培养液的不同盐度,在实验室条件下检验了笼目海带(Saccharina sculpera)在不同盐度的培养液中配子体生长发育情况。结果显示,在盐度20～30的条件下,笼目海带配子体大部分(60%～80%)进入了生殖生长状态,且其中50%以上为多细胞孢子体；在盐度35的条件下,大部分(80%～90%)笼目海带配子体维持在营养生长状态,虽然有小部分(7.30%)配子体进入了生殖生长状态,但生殖生长明显滞后于盐度20～30处理组。在盐度为40和45的培养条件下,所有海带配子体维持在营养生长状态。根据试验结果,建议将笼目海带配子体育苗的盐度保持在20～30。