日本鳗鲡TRAF3基因的克隆及功能研究

为探究鱼类TRAF3在鱼类抗病毒免疫应答中的功能及作用机制,实验利用逆转录PCR克隆获得了日本鳗鲡TRAF3转录本 (AjTRAF3),利用生物信息学软件分析了AjTRAF3的结构特征,利用实时荧光定量 PCR(qPCR)、双荧光素酶报告系统以及免疫共沉淀等方法对其表达规律、功能及作用机理进行了初步分析。AjTRAF3的开放阅读框长度为1 707 bp,编码568个氨基酸。序列结构分析结果显示,AjTRAF3由N端的环结构域2个锌指结构域以及1个螺旋结构域和C端高度保守的TRAF-C (MATH)结构域组成。qPCR结果显示,AjTRAF3在日本鳗鲡各组织中均有表达,脑组织中表达量最高,其次为头肾,心脏中的表达量最低。Poly I:C刺激6 h后,日本鳗鲡脾脏组织中AjTRAF3上调倍数最高,为对照组的15.83倍。迟缓爱德华氏菌感染24 h后,日本鳗鲡脾脏组织中AjTRAF3上调倍数最高,为对照组的31.47倍。此外,本研究构建了AjTRAF3真核表达质粒,发现过表达AjTRAF3能显著上调炎症及抗病毒相关基因的表达,可显著增强AjIFN2、AjIFN4和NF-κB启动子荧光素酶活性。并能显著上调由AjRIG-IN、AjMAVS、AjIRF3诱导的AjIFN2、AjIFN4和NF-κB启动子活性。免疫荧光结果显示,AjTRAF3主要定位于细胞质中,且与AjMAVS存在共定位。免疫共沉淀结果显示,AjTRAF3通过MATH结构域与AjMAVS相互结合,缺失该结构域后,其与AjMAVS的相互作用消失,推测AjTRAF3可通过介导RIG-I/MAVS信号转导途径调控鱼类的抗病毒免疫应答。本研究结果为进一步揭示鱼类TRAF3的生物学功能奠定了基础。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道。本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因c DNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp。SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ)。经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12 h后表达量达到0 h时的13.20倍。使用LPS、PGN、Poly I:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与Poly I:C均下调基因表达。以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。     

半滑舌鳎甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1基因的克隆及表达分析

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1(Mannan-binding lectin associated serine protease 1,MASP1)是补体凝集素途径中起重要作用的激活蛋白。本研究以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,应用RACE技术和实时荧光定量qRT-PCR技术对半滑舌鳎MASP1基因(Cynoglossus semilaevis MASP1,CsMASP1)进行了克隆和表达模式分析。结果显示,CsMASP1基因c DNA序列全长为2507 bp,5′非编码区长82 bp,3′非编码区长142 bp,开放阅读框长2283 bp,共编码760个氨基酸;CsMASP1基因包含13个外显子和12个内含子,与多数已知鱼类的MASP1基因结构一致;SMART分析显示,CsMASP1包含6个结构域,与哺乳动物、鸟类、其他鱼类的结构域一致;同源比对发现,CsMASP1和鱼类的相似度较高,与金目鲈(Latescalcarifer)的相似性最高,为76%。CsMASP1基因在11种健康组织(血液、脑、鳃、性腺、心脏、头肾、肠、肝、皮肤、脾和后肾)中均有表达,其中,在肝、脾和头肾中表达量较高;鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染后,CsMASP1基因在6种免疫组织(血液、鳃、头肾、肠、肝和脾)中呈现不同的表达模式,在6种免疫组织中呈现明显的上调表达,肝的表达峰值出现在感染后24 h;脾和鳃的表达峰值出现在感染后6 h;肠、头肾和血液的表达峰值均出现在感染后12h;随着病原菌感染时间增加,基因表达量逐渐降低并恢复至正常水平。研究表明,CsMASP1基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程,本结果为半滑舌鳎的免疫机理研究奠定了基础。     

刀鲚PPARγ基因的cDNA克隆及其应激应答

旨在研究刀鲚(Coilia nasus)过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor, PPARγ)基因的应激调控表达,克隆并获得了刀鲚PPARγ基因的cDNA全长。刀鲚PPARγ基因的cDNA全长1951 bp,开放阅读框1470 bp,预测编码489个氨基酸。刀鲚PPARγ包括4个功能结构域,即A/B区, DNA结合区(DNA binding domain, DBD区),铰链区,配体结合区(ligand binding domain, LBD区)。运用荧光定量PCR (real time quantitative PCR, RT-qPCR)检测刀鲚PPARγ基因在不同组织、运输胁迫和胚胎发育时期的表达。结果显示,刀鲚PPARγ在各组织中均有表达,其中在肝中表达量最高,在脑、肠、心脏、肾、头肾、肌肉中相对高表达,在鳃和脾中微量表达。运输胁迫过程中, PPARγ基因表达显著上调(P0.05),在4 h达到峰值,随后显著降低,但仍高于对照组。PPARγ在胚胎发育时期各时期均表达,其中在受精卵时期高表达,随后表达量急剧降低,并在此后的时期一直处于较低的表达水平。PPARγ基因在应激过程中发挥重要作用,也是胚胎发育过程中重要的基因。本研究为刀鲚的人工繁育和应激调控提供了理论基础。     

魁蚶HIF-1α基因结构特征及对低氧胁迫的响应

低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)是低氧信号传导途径中的关键因子,在动物低氧应答反应中发挥重要作用。为探讨魁蚶(Scapharca broughtonii) HIF-1α基因结构特征及在低氧胁迫下的应答规律,本研究以魁蚶转录组数据库中的部分序列为基础,通过cDNA末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends, RACE)技术克隆获得了魁蚶HIF-1α基因cDNA全长序列(命名为SbHIF-1α),并检测了其mRNA的组织分布和低氧胁迫下的表达规律。序列和结构分析显示, SbHIF-1α基因cDNA全长为2741 bp,其中包括2136 bp的ORF,编码711个氨基酸,含有HIF保守的HLH、PAS-A、PAS-B和PAC结构域,预测蛋白分子量为80.8kDa,理论等电点为5.57;SbHIF-1α与所选其他物种HIF-1α的序列相似度为56%～95%;系统进化分析显示SbHIF-1α与软体动物的遗传距离最近。qRT-PCR结果显示,在魁蚶的血淋巴、鳃、外套膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺6个组织内均能检测到SbHIF-1α基因,在血淋巴中表达量最高,鳃次之,与其他4个组织都存在显著差异(P0.05)。海水溶解氧(DO)为0.5 mg/L、2.5 mg/L、4.5mg/L的低氧胁迫下,每个组织中SbHIF-1α都积极响应,其中血淋巴和鳃比其他四个组织的响应程度大;血淋巴中, DO为0.5 mg/L胁迫4 h后, SbHIF-1α的表达量较对照组即达到极显著差异(P0.01),胁迫64 h后,表达量达到最高,是对照组的519.43倍;每个组织对不同浓度DO处理响应结果表明,3个处理浓度中0.5mg/L处理对SbHIF-1α激活程度相对较大。本研究明确了SbHIF-1α的基因结构特征、时空表达特征及对低氧胁迫的响应规律,丰富了海洋贝类HIF基因的研究资料。     

半滑舌鳎骨形态发生蛋白4基因的克隆和表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)骨形态发生蛋白4(BMP4)基因的c DNA序列,并分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达分布及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势。结果表明,半滑舌鳎BMP4基因c DNA全长为1680 bp,包括了419 bp的5′非翻译区(5′UTR)、编码403个氨基酸的1212 bp的开放阅读框(ORF)以及49 bp的3′非翻译区(3′UTR)。同源性分析和分子进化聚类分析结果显示,半滑舌鳎与已报道慈鲷科(Cichlidae)各鱼种的同源性最高,并与之共同聚为鱼类BMP4分支。BMP4 m RNA在半滑舌鳎成鱼的13个组织中具有广泛的分布,并在鳃组织中表达量最高,其次在背鳍、软骨等组织具有中等水平的表达。此外,BMP4基因在早期胚胎发育阶段(卵裂期和原肠期)具有极高水平的表达,此后其表达水平逐渐降低;但在后期仔鱼期(孵化后3日龄和4日龄),其表达水平再次升高。整体原位杂交检测结果表明,BMP4 m RNA在早期仔鱼期主要在头部及躯干前部表达;后期仔鱼BMP4基因主要在冠状幼鳍、上下颌及胸鳍处表达;进入稚鱼期后在鳃盖骨及各鳍均有表达。上述研究结果揭示了BMP4在半滑舌鳎早期骨骼发育中的重要作用,为揭示海水硬骨鱼类骨骼发生、发育的调控机制奠定了理论基础。     

曼氏无针乌贼Phb2基因的克隆和其在不同生长阶段的表达分析

Phb2是抗增殖蛋白(Prohibitin)的一个亚型。本研究利用RACE技术首次获得了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Phb2基因的全长序列,该序列全长为1283 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)150 bp,3′非编码区(3′-UTR)236 bp,开放阅读框(ORF)897 bp,预测编码298个氨基酸。序列分析表明,曼氏无针乌贼Phb2基因编码的蛋白无信号肽,第20~42位氨基酸为跨膜结构,包含1个PHB家族的结构域。采用荧光定量PCR技术检测其在曼氏无针乌贼不同生长时期(幼体、产卵前、产卵中、产卵后濒死前)各组织中的表达情况,结果显示,Phb2在4个时期的各组织中均有表达,其中,幼体和濒死前表达量较低,产卵前和产卵中的表达量则相对较高,在各时期中脑、肝表达较多。视腺作为与生殖调控有关的内分泌器官,其Phb2基因表达具有时期差异性,在产卵后的表达量由产卵时期的高表达大幅下降,说明Phb2具有周期调节、控制细胞衰老和凋亡的多效性功能。本研究结果可为进一步了解抗增殖蛋白对曼氏无针乌贼的抗衰老作用提供参考。     

中国明对虾Dscam基因的克隆及其在免疫致敏(类免疫)诱导反应中的表达分析

为了研究对虾免疫致敏过程中Dscam基因的表达规律,实验采用同源克隆和RACE技术获得了中国明对虾Dscam基因c DNA全长序列,并对该序列进行生物信息学分析。结果显示,中国明对虾Dscam基因的c DNA全长为6 624 bp,其中包括171 bp的5′端非编码区,459 bp的3′端非编码区,开放阅读框的长度为5 994 bp,编码1 996个氨基酸。推测该基因编码的蛋白含有一个信号肽、10个Ig结构域、6个FNIII功能区、1个胞质尾区和1个跨膜结构域。同源性分析及系统进化分析表明,Dscam基因与节肢动物的Dscam基因首先聚为一类,且与凡纳滨对虾的同源性最高,为92.4%。连续投喂6 d热灭活白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)饵料来诱导免疫致敏反应,在0、6和12 d及二次感染后的12、24、48、72和168 h分别取样,用RT-PCR的方法检测中国明对虾Dscam的相对表达量。结果显示,诱导感染组Dscam基因在第12天开始上调,且与阴性对照组和未诱导感染组差异显著;二次感染后24 h,Dscam基因的相对表达量达到最大值,与阴性对照组和未诱导感染组差异显著;48 h后基因表达量开始下降,但表达量仍高于阴性对照组和未诱导感染组。实验表明,中国明对虾存在Dscam基因,并在免疫致敏过程中发挥重要作用。     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法，首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟，中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD， 896 kD和924 kD；3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD，都具有29 kD的轻链，其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明，3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性，在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别，而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示，3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应，但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应，这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的，而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

珠江口海域双胞旋沟藻赤潮对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性

为研究2009年10月下旬在广东珠海海域爆发的双胞旋沟藻赤潮对养殖鱼类及水体中其它生物的影响,实验以卤虫幼体、金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗作为受试生物,在赤潮现场测试双胞旋沟藻对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性效应。结果显示,24 h双胞旋沟藻对卤虫幼体的LC₅₀(半致死浓度)为9.55×10⁴/mL,藻密度为2.5×10³/mL的双胞旋沟藻对卤虫幼体的LT₅₀(半致死时间)为48.5 h。60 h内该赤潮水体对鱼苗和虾苗的存活无不利影响,卤虫幼体和金鼓鱼苗均可摄食双胞旋沟藻,卤虫幼体对双胞旋沟藻的摄食率低。研究表明,双胞旋沟藻赤潮水体对卤虫幼体有一定的毒性作用,但在低藻密度条件下,卤虫幼体能以该藻为食并维持其生命,双胞旋沟藻对金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗无急性毒性作用。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

花鲈ncc、nkcc基因在海、淡水适应中鳃组织的表达与定位分析

为探究ncc、nkcc基因在花鲈渗透调节中发挥的作用,实验通过全基因组鉴定、多重序列比对、系统进化树构建以及蛋白结构预测对花鲈ncc进行了鉴定及序列分析,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测ncc和nkcc在海水、淡水花鲈鳃组织中的表达水平,利用原位杂交技术确定ncc2和nkcc1a在海水及淡水花鲈鳃中的表达位置。结果显示,从花鲈中鉴定出2个ncc基因,即ncc1和ncc2,其编码序列(CDS)长度分别为2 691和3 120bp,编码896和1 039个氨基酸,在进化上具有保守性。ncc2在淡水花鲈鳃组织中的表达量显著高于海水,而nkcc1a在海水花鲈鳃组织中的表达量显著高于淡水,ncc1、nkcc1b、nkcc2在海淡水中的表达量则无显著差异。淡水适应过程中花鲈鳃组织中的ncc2的表达量逐渐上调,而nkcc1a的表达量逐渐下调;海水适应过程则呈现相反的表达趋势。此外,原位杂交结果显示,ncc2和nkcc1a基因分别位于淡水与海水中鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮。以上结果表明,ncc2和nkcc1a基因分别编码淡水及海水花鲈鳃中重要的Na⁺及Cl     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.     

溶藻弧菌相关分离株的分子及VITEK鉴定

哈维群弧菌是弧菌属的核心菌群,包括溶藻弧菌在内的6个种在表型和遗传型上均十分相似,要准确鉴定各种有一定难度。看家基因的研究及生化鉴定系统的出现为弧菌鉴定提供了多种方法,本文比较了16S rRNA基因、toxR基因和pyrH基因以及VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对溶藻弧菌相关分离株的分辨力。哈维群弧菌基因组内16S rRNA基因是多拷贝的,且拷贝间序列差异大于种间差异,不适用于种的鉴定。单拷贝基因toxR和pyrH序列种内差异均小于种间差异。基于toxR基因相似性比较可清楚地将18个疑似溶藻弧菌分离株和5个参比株归并到4个种;toxR基因系统发育学分析也显示,哈维群弧菌各种独立地聚类分支,且溶藻弧菌种内存在两个明显的聚类分支,说明两个分支的溶藻弧菌具有独立的进化方向。pyrH基因的相似性比较和发育学分析也得到类似的结果,但pyrH基因具有较强的保守性,因而分辨力稍低于toxR基因。VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡在鉴定溶藻弧菌时也有一定的错误率,且鉴定谱较窄。因此,建议在实际应用中采用toxR基因比对作为溶藻弧菌快速鉴定的主要手段,可再选用pyrH基因对鉴定结果进行验证。     

倒刺鲃属三个种之间种间杂交的初步研究

采用人工催产和干法授精技术,进行了以中华倒刺鲃、倒刺鲃为母本与其父本及黑脊倒刺鲃雄鱼的种间杂交实验,获得4个杂交组合和2个自交组合,在(27±0.5)℃温度条件下,对其F₁卵膜径、受精率、孵化率、孵化时间、畸形率、子代早期形态特征与成活率进行了比较,同时,观察了胚胎发育及其异常现象,结果表明:以中华倒刺鲃为母本的F₁卵膜径差异不显著;以倒刺鲃为母本的F₁卵膜径,在多细胞期时差异不显著,在耳石期时,倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁卵膜径显著大于母本(P<0.05)。杂种F₁的受精率、孵化时间与母本差异不显著,畸形率显著高于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁的孵化率较高,与母本差异不显著(P<0.05)。倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁的孵化率与母本之间差异不显著,倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂F₁的孵化率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁仔鱼早期发育阶段存在死亡高峰期,成活率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃种间杂交和倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂杂种F₁既具有父本特征,同时又具有母本特征,初步证明倒刺鲃属种间杂交是可行的。     

鲢鳙混养对三角帆蚌生长和养殖水质影响的围隔实验

2008年4月23日—9月21日通过围隔实验,研究了不同鲢鳙混养比例对三角帆蚌生长及水化学指标的影响。实验中鲢鳙混养比例设置了6个水平,分别为0/0(对照组),100/0,70/30,50/50,30/70和0/100。实验开始和结束时测量三角帆蚌湿重,壳长和壳宽。每个月上下旬测量围隔水化学指标包括NO3N、NO2N、NH3N、TN、TP、PO4P和COD。实验结果表明,鲢鳙混养比例100/0的围隔蚌壳长相对生长率显著低于混养比例0/0,50/50和0/100的围隔(P<0.05),而不同混养比例下蚌的成活率、蚌壳宽及蚌重增长均无显著差异(P>0.05)。从水质来看,混养比例30/70围隔TP显著低于100/0(P<0.05),COD显著低于100/0及70/30(P<0.05),NH3N显著低于100/0(P<0.05)以及PO4P显著低于70/30(P<0.05)。因此,综合蚌生长及水质指标,混养比例30/70围隔对三角帆蚌养殖最有利。     

欧洲鳗短钩拟指环虫病及其鳃组织病理

报道了患短钩拟指环虫病欧洲鳗的症状、流行状况和鳃显微组织病理.游动和呼吸频率异常、鳃丝浮肿和鳃上粘液增多为该病的主要症状.该病尽管在冬季也有发生,但水温在26℃以上的春末、夏季和秋初是最易发病的流行季节,流行出现明显的季节性变化.患病欧洲鳗鳃的组织病理变化主要表现出5种类型,其一是鳃小片上皮细胞增生,使邻近的鳃小片相连;其二是鳃小片粘液细胞增生,同样使鳃小片连成一片,增生的粘液细胞经阿利新蓝(Alclan blue)和过碘酸雪夫氏(Periodic acid schiff)二者联合染色后呈蓝紫色的染色反应,属于Ⅳ型的粘液细胞;其三是鳃小片肿大,但单层扁平上皮细胞无肿大现象,上皮细胞层与毛细血管相分离,鳃小片上皮细胞坏死,上皮细胞层破裂,血细胞外溢,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,失去鳃小片原有的结构;其四是鳃小片肿大同时伴随单层扁平上皮细胞肿大,进一步发展,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,鳃小片同样失去原有的结构;其五是鳃小片毛细血管严重充血扩张,比原毛细血管扩张几倍到十几倍,形成充满红细胞的棒状到球状的动脉瘤.结果表明鳃上皮细胞增生、粘液细胞增生、鳃小片肿大、上皮细胞坏死脱落和严重充血成动脉瘤等病理变化都可导致患病欧洲鳗呼吸困难,轻者影响其生长,重者最终因呼吸衰竭而死亡.