四指马鲅淋巴器官发育组织学观察

采用石蜡组织连续切片和HE染色技术,对1~60 dph(Days post hatching)四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)的淋巴器官个体发育进行研究,描述了淋巴器官发育特点及组织学特征。结果显示,在盐度为9.0±0.5,水温为(28±2)℃条件下,3 dph胸腺原基出现,由4~6层未分化干细胞和淋巴母细胞样的细胞组成;胸腺发育迅速,主要由淋巴细胞填充;至25 dph皮质区和髓质区分明显,胸腺发育基本完成。3 dph头肾原基形成,由前肾管和少量造血干细胞组成;5 dph胸腺淋巴细胞向头肾迁移,头肾开始淋巴化;随着鱼体生长,造血干细胞分化成不同类型细胞;18 dph前肾管开始退化,至53 dph完全消失,头肾主要由网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成。7 dph脾脏原基形成,至16 dph开始淋巴化;脾脏内皮系统较头肾发达,但其发育速度较胸腺和头肾慢,淋巴细胞明显少于胸腺和头肾。研究表明,四指马鲅淋巴器官原基出现及淋巴化的顺序是胸腺、头肾、脾脏。免疫淋巴器官结构及功能尚未发育完善,可能是四指马鲅在变态期间幼体死亡率高的主要原因之一。     

细鳞鲑早期发育过程中免疫器官发生

应用连续切片技术和显微观察法,对胚胎末期至仔鱼期的细鳞鲑(Brachymystax lenok)免疫器官(头肾、胸腺及脾组织)早期发育进行了系统研究。研究表明,在实验水温为10.0～16.2℃时,细鳞鲑的免疫器官原基发生及其淋巴化的先后顺序均为胸腺、头肾和脾。仔鱼出膜前5 d胸腺原基形成,出膜前1 d胸腺即出现少量淋巴细胞,仔鱼19日龄后,结缔组织和毛细血管渗入胸腺实质而形成小梁,仔鱼35日龄左右,胸腺己经分化出模糊的内区和外区;仔鱼出膜前2 d,出现头肾原基,由未分化的造血干细胞组成,仔鱼3日龄后,头肾由肾小管构成,10日龄后,组织开始淋巴化,仔鱼35～45日龄,肾小管上皮细胞开始退化,头肾内出现血窦,并进一步淋巴化,50日龄后,肾小管退化完毕,头肾主要由淋巴组织和大量血窦构成;5日龄细鳞鲑仔鱼,脾原基出现,16日龄后,脾开始淋巴化,35～50日龄,脾内建立起发达的微血管系统以及血窦结构。细鳞鲑的免疫器官分化较早,其发育速度较其他淡水硬骨鱼类相对滞后,但组织淋巴化速度较快。本研究旨在揭示细鳞鲑早期死亡率高的根本原因,为实现细鳞鲑的规模化养殖提供科学基础。     

卵形鲳够免疫器官的早期发育

研究了卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）仔、稚鱼期间3种免疫器官的发生和发育过程。结果表明,3种免疫器官原基出现的先后顺序是头肾、脾脏和胸腺,出现时间分别为2日龄、3日龄和3日龄。其中,头肾的早期发育过程可分为原基形成期、造血功能发展期和泌尿功能退化期。进入稚鱼期后头肾的肾小管分布相对减少,表明头肾已不是主要的泌尿功能区。6-8日龄仔鱼脾脏中造血干细胞向红血细胞分化并产生大量未成熟红细胞。22日龄时脾脏组织体积进一步增大,内部血细胞参与血液循环。胸腺原基出现后胸腺细胞增多、体积增大,细胞嗜碱性不强。10-13日龄时胸腺细胞的嗜碱性增强,淋巴细胞开始增多,此时胸腺开始分区。20-22日龄稚鱼期结束时胸腺的内区和外区进一步分化,分区更为明显,表明胸腺进一步成熟。未发现胸腺和头肾之间淋巴细胞迁移的现象。     

孵化至12月龄大黄鱼免疫器官的发育变化

研究孵化至12月龄大黄鱼的淋巴器官如头肾、胸腺、脾的生长发育和免疫细胞数量的变化,首先应用显微与超微技术研究大黄鱼初孵仔鱼至12月龄免疫器官——头肾、胸腺与脾脏的发育。3日龄仔鱼出现头肾原基,原始造血干细胞最早被发现于头肾,很快分化成不同类型的细胞。4日龄仔鱼出现脾脏原基和胸腺原基。脾脏靠近内脏,含大量窦状隙,有丰富的毛细血管、血细胞与血小板。胸腺是最迟出现的淋巴器官,但发育较快。胸腺位于鳃腔背上角,主要由胸腺细胞(淋巴细胞)和上皮细胞组成,分为外区和内区,二者虽没有明显界限,但容易区分。研究结果还表明,随着年龄和鱼体重量的增长,胸腺、头肾和脾脏的重量均有增长的趋势,脾脏重量与体重的关系要比与年龄的关系更为密切,头肾、胸腺重量与年龄的关系要比与体重的关系更为密切。胸腺、头肾和脾脏的白细胞总数随着年龄的增长不断增加。但每毫克胸腺、头肾和脾脏内白细胞数量与年龄间线性关系不明显。头肾比脾脏淋巴化程度高。在研究中发现,血液内各细胞组成与大黄鱼月龄及季节的变化没有明显的改变。     

鳜淋巴器官的个体发育

运用连续石蜡切片技术和组织学观察方法,对常规孵化出膜后1～33日龄鳜(Siniperca chuatsi)淋巴器官个体发育过程的组织学特点进行研究。结果表明,水温23～25℃时,出膜后第4天,部分仔鱼开始摄食并逐渐转入外源性营养阶段。同样水温条件下,出膜后第3天,出现胸腺原基,然后胸腺迅速淋巴化,能明显分为外区、中区和内区。鳜在出膜时已存在原肾管,原肾管前部分发育为头肾原基,由一些造血干细胞和肾小管组成;后部分发育为中肾和后肾,主要由肾小管组成。随着个体发育,头肾的淋巴细胞数量增多,肾小管数量减少,头肾逐渐由排泄器官转化为淋巴器官。出膜后第5天,观察到脾脏原基,脾脏主要由造血细胞和淋巴细胞组成,淋巴化速度较慢。至出膜后30天左右,体形和淋巴器官的发育情况基本与成鱼相似。鳜淋巴器官原基出现的顺序是头肾、胸腺、脾脏;而这些器官淋巴化的顺序是胸腺、头肾和脾脏。     

军曹鱼淋巴器官发育的形态学研究

运用组织学及组织化学的染色方法,对出膜后第1～44天(Days post-hatch,dph)的军曹鱼Rachycentron canadum头肾、脾脏和胸腺发育过程进行研究.首先观察到前肾管,3 d后,在肾管附近发现原始的造血千细胞,逐渐有红细胞和大淋巴细胞产生.之后,脾脏出现,其内毛细血管和红细胞丰富,还分布少量巨噬细胞.胸腺虽然是最后出现的淋巴器官,但是发育的非常快,内外分区明显.可以得出其淋巴器官出现顺序是头肾、脾脏和胸腺.在小淋巴细胞出现前,发现各淋巴器官内存在一些与非特异免疫机制相关的细胞,如巨噬细胞和网状细胞等.淋巴器官原基出现后开始淋巴化,其顺序是胸腺、头肾和脾脏.在采样的时间段里未观察到浆细胞,可能军曹鱼淋巴器官至此仍未发育成熟.     

草鱼头肾发生组织学与免疫组织化学观察

为研究草鱼头肾的组织发生发育,应用组织学技术,对1 ～ 103 dph(day post hatching)的草鱼头肾进行观察分析,描述了头肾的组织结构变化及免疫球蛋白M(IgM)阳性细胞及过碘酸雪夫氏(PAS)阳性细胞的发生和分布.结果显示,6 dph,出现头肾原基,原基中原肾管分化形成的肾小管之间出现散在的干细胞.7 dph至16 dph,造血干细胞逐渐分化成不同类型的细胞,免疫细胞数量逐渐增加;17 dph至103 dph,肾小管逐渐退化至完全消失,网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成头肾的主要部分.40 dph肾上腺细胞团开始出现.65 dph与成鱼头肾的组织结构接近,作为淋巴-肾上腺组织存在.PAS阳性细胞最早在7 dph出现;IgM阳性细胞最早出现于17 dph;之后,IgM阳性细胞及PAS阳性细胞逐渐增多,分布于整个头肾组织.研究表明,65 dph草鱼头肾在组织上发育基本成熟;头肾作为草鱼免疫器官的早期发育可以分为3个阶段:无参与免疫反应的细胞、只具有参与非特异性免疫反应的细胞以及参与非特异性免疫反应及特异性免疫反应的细胞组织结构逐步发育完善.     

太平洋鳕(Gadus macrocephalus Tilesius)仔鱼发育过程

采用显微观察、拍照、测量的方法,对太平洋鳕(Gadus macrocephalus Tilesius)人工培育苗种各阶段仔鱼的发育(0–80 dph day post hatching)进行了研究。结果显示,在水温为2–12℃、盐度为28–32、p H为7.8–8.2、光照为800–1200 lx、微充气静水的培育条件下,太平洋鳕早期仔鱼发育主要特征为:0–5 dph仔鱼完全营内源性营养,1 dph仔鱼黑色素沉积较初孵仔鱼颜色加深,眼球出现彩虹色素,5 dph仔鱼消化道已打通(除肝脏外);6 dph仔鱼开口摄食,消化道内有小颗粒物质,营混合性营养;9 dph大部分仔鱼卵黄囊吸收完毕,消化道内充满褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis),进入外源性营养期,血细胞流动清晰可见;12 dph仔鱼头部黄色色素带明显;15 dph仔鱼黑色素和黄色素密集,鳔器官开始形成;17 dph仔鱼开始出现彩虹色素;20 dph仔鱼眼球发育完善,腹动脉可观察到明显的血流,鱼体尾部色素点开始出现;30–50 dph仔鱼各鳍条雏形发育;30 dph仔鱼尾鳍鳍条开始发育;40 dph仔鱼开始摄食卤虫(Artemia sp.),第1、2、3背鳍已出现雏形;50 dph仔鱼尾椎骨开始上翘,臀鳍、背鳍雏形已清晰可见;60–80 dph仔鱼色素细胞进一步发育,各鳍条逐步发育完善,胆囊清晰可见;60 dph仔鱼鳃部呈现红色;70 dph仔鱼腹部有银白色鳞片雏形出现;80 dph仔鱼鳃盖已基本发育完善,腹鳍出现。本研究对太平洋鳕仔稚鱼发育过程进行了描述,可为后续规模化人工繁育的开展提供基础数据。     

太平洋鳕(Gadus macrocephalus Tilesius)仔鱼发育过程

采用显微观察、拍照、测量的方法,对太平洋鳕(Gadus macrocephalus Tilesius)人工培育苗种各阶段仔鱼的发育(0-80 dph day post hatching)进行了研究.结果显示,在水温为2-12℃、盐度为28-32、pH为7.8-8.2、光照为800-1200 Ix、微充气静水的培育条件下,太平洋鳕早期仔鱼发育主要特征为:0-5 dph仔鱼完全营内源性营养,1 dph仔鱼黑色素沉积较初孵仔鱼颜色加深,眼球出现彩虹色素,5 dph仔鱼消化道已打通(除肝脏外);6dph仔鱼开口摄食,消化道内有小颗粒物质,营混合性营养;9dph大部分仔鱼卵黄囊吸收完毕,消化道内充满褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis),进入外源性营养期,血细胞流动清晰可见;12dph仔鱼头部黄色色素带明显;15dph仔鱼黑色素和黄色素密集,鳔器官开始形成;17dph仔鱼开始出现彩虹色素;20 dph仔鱼眼球发育完善,腹动脉可观察到明显的血流,鱼体尾部色素点开始出现;30-50 dph仔鱼各鳍条雏形发育;30 dph仔鱼尾鳍鳍条开始发育;40dph仔鱼开始摄食卤虫(Artemia sp.),第1、2、3背鳍已出现雏形;50dph仔鱼尾椎骨开始上翘,臀鳍、背鳍雏形已清晰可见;60-80 dph仔鱼色素细胞迸一步发育,各鳍条逐步发育完善,胆囊清晰可见;60 dph仔鱼鳃部呈现红色;70dph仔鱼腹部有银白色鳞片雏形出现;80dph仔鱼鳃盖已基本发育完善,腹鳍出现.本研究对太平洋鳕仔稚鱼发育过程进行了描述,可为后续规模化人工繁育的开展提供基础数据.     

施氏鲟的性腺分化及养殖水温对其性腺分化的影响

利用组织学方法观察了养殖施氏鲟(Acipenser schrenckii)原始生殖细胞(PGCs)的起源、迁移和原始生殖腺的形成及分化。结果表明,施氏鲟PGC最早出现于1.5 dph(days post-hatching)的仔鱼中肾管(又称吴尔夫氏管)原基一侧的中胚层中。3~7 dph,PGCs数目增多,并聚集成细胞索,17~31 dph,PGCs沿肠系膜向肾管区下方迁移,并与生殖嵴细胞一起形成原始性腺;40～60 dph时成群的小细胞团由肾区向原始性腺迁移,原始性腺上皮细胞柱状;90~120 dph,原始性腺中出现生殖上皮和性细胞,脂肪细胞和血管增多。180 dph以后,施氏鲟幼鱼性腺在组织学水平上出现光滑型(精巢)和褶皱型(卵巢)2种性腺组织结构,标志施氏鲟幼鱼性腺在解剖学水平上已经分化。本实验结果表明,孵化后31～180 d为其性腺分化的关键期。将孵化后56 d的仔鱼分别在不同的水温(27℃±0.5℃、24℃±0.5℃、21℃±0.5℃、18℃±0.5℃和15℃±0.5℃)中培育至210 d,组织学观察其性腺的发育和分化,结果发现,温度可影响施氏鲟幼鱼性腺分化的时间,但不影响其性腺分化的方向。高温(24℃和27℃)可使施氏鲟幼鱼提前性腺分化,其中27℃组较对照组(21℃)提前50 d,24℃组提前30 d;低温(15℃组)则延长幼鱼性腺分化的时间。施氏鲟幼鱼的性别分化不属于温度依赖型。     

Ontogeny of immune system organs in northern bluefin tuna (Thunnus orientalis, Temminck and Schlegel 1844)

Serial sections, prepared from 0.5 to 30 days posthatch (dph) larval and juvenile Thunnus orientalis (Temminck & Schlegel 1844), were stained with haematoxylin and eosin and examined by light microscopy for immune organ development. The early kidney was present at 0.5 dph, undifferentiated stem cells began to appear at 2 dph, and by 7 dph occasional small lymphocytes were present. The thymus was first obvious at 5 dph, located above the fourth branchial arch, small lymphocytes appeared at 7 dph, and by 15 dph an outer thymocytic zone and an inner epithelioid zone were visible. The progenitor spleen was present at 2 dph, located close to the gut, and by 12 dph it consisted of a mass of sinusoids filled with red blood cells, and remained mainly erythroid throughout the period studied. These results suggest that development of immune organs in this species is precocious relative to other marine teleosts.     

太平洋鳕RAG1和IgM基因荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和IgM基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点.根据GenBank中RAG1和IgM的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和IgM的基因片段.将所获基因片段分别插入到克隆载体pMD18-T中,从而构建太平洋鳕RAG1和IgM基因的质粒标准品.建立并优化太平洋鳕RAG1和IgM基因绝对荧光定量PCR方法.为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异.以优化后的绝对荧光定量PCR方法检测不同发育时期太平洋鳕RAG1和IgM的表达情况.结果显示,RAG1的回归方程为y=-3.266x+33.77,回归系数R2=0.996;IgM的回归方程为y=-3.119x +27.61,回归系数R2 =0.998.绝对定量和相对定量结果在基因转录趋势上显现出一致性,即RAG1基因在胸腺和头肾中表达,且在胸腺中的表达量显著高于头肾中的表达量,在肝脏和脾脏中无表达;IgM基因在胸腺、头肾、肝脏和脾脏中均有表达,其中脾脏中表达量最高,其次是头肾.RAG1基因在太平洋鳕发育早期的表达水平很低,到61日龄(days posthatching,dph)至95 dph表达量显著提高;IgM基因在早期表达水平同样很低,到33 dph至61 dph才有明显表达,在95 dph时表达量显著提高.研究表明,本实验方法可靠,特异性较强,可成功对目标基因转录水平进行检测.     

Ontogeny of digestive and immune system organs of larval and juvenile kelp grouper Epinephelus bruneus reared in the laboratory

ABSTRACT:   A histological examination was made of the ontogenetic development of the digestive and immune systems of the larval and juvenile kelp grouper Epinephelus bruneus reared in the laboratory. The liver, gall bladder, pancreas and the demarcating region between the intestines and rectum were formed within 3 days post-hatch (dph). During the preflexion phase (within 16 dph), revolution of the intestine concluded, and pharyngeal teeth and the mucous cells of the esophagus were differentiated. In the transitional period to the juvenile stage (25 dph), the blind sac of the stomach, gastric glands and pyloric caeca began to form. From the viewpoint of the differentiation phase of the adult-type digestive system, the kelp grouper is similar to Heterosomata, hitherto reported. The primordial thymus, kidney and spleen were present at 12, 1 and 6 dph, and the small lymphocytes in these lymphoid organs appeared at 21, 30 and 33 dph, respectively. The developmental sequence of the lymphoid organs and the appearance ages of the lymphoid organs and small lymphocytes in the lymphoid organs in the kelp grouper are similar to those of other marine fish previously reported, except for the Pacific bluefin tuna Thunnus orientalis .     

鳜仔稚鱼骨骼系统骨化发育

采用软骨―硬骨双染色技术,描述了鳜(Siniperca chuatsi)仔稚鱼(1～35日龄)头骨、脊柱、附肢骨骼的骨化发育特征。结果显示:(1)头骨前鳃盖骨于14日龄最先骨化, 15日龄上下颌骨骨化,且上下颌骨相对长度呈现连续变化过程。17日龄后,颌齿、关节骨、舌颌骨骨化;19日龄,隅骨、间鳃盖骨、鳃盖骨、鳃条骨、额骨骨化。20日龄后,方骨、下鳃盖骨、辅上颌骨等骨化; 35日龄,头骨骨化基本完成。(2)脊柱于15日龄由前向后骨化, 20日龄背肋与腹肋由基部向末端骨化, 29日龄骨化完成。脉弓与脉棘、髓弓与髓棘均由前向后、由基部向末端骨化,脉棘与髓棘骨化时间晚于相应的椎体。(3)附肢骨骼骨化顺序依次为胸鳍、背鳍、臀鳍、腹鳍、尾鳍。胸鳍匙骨于16日龄骨化,乌喙骨与肩胛骨于25日龄骨化;背鳍、臀鳍分别于18日龄、20日龄骨化,骨化方式相似;腹鳍于23日龄骨化,骨化方式与胸鳍相反;尾杆骨、尾下骨于25日龄骨化,附肢骨骼于35日龄基本骨化完成。结果表明,鳜骨骼骨化发育与其早期运动、摄食与御敌等行为密切相关。     

miR-124和Otx2在牙鲆变态发育期间的表达调控及其靶向关系验证

牙鲆(Paralichthysolivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400bp含有"种子序列"的Otx23′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明:pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致; TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32dph、36dph时期,pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。