中药抗体复合制剂防治仔猪腹泻试验

选择待开产未经大肠杆菌免疫来航蛋鸡150只,用ETEC K88+菌株C83907进行免疫后,收集高免蛋制备卵黄抗体粉。将中药提取物、卵黄抗体粉与载体按比例混合制成中药抗体复合制剂。分别选择3日龄和21日龄的杜×长×大三元杂交早期断奶仔猪18只和40只,人工感染C83907大肠杆菌后,口服含制备的中药抗体复合制剂进行被动免疫试验。结果表明:3日龄仔猪服用抗ETEC中药抗体复合制剂后,平均增重接近对照组(p>0.05),仔猪死亡率显著小于对照组(p<0.01)。21日龄服用中药抗体复合制剂组的仔猪增重高于卵黄抗体组(p<0.05)。研究结果表明,喂以6 g和10 g抗ETEC卵黄粉组的治愈率与抗生素治疗组差异不显著(p>0.05),比单一使用纯中药和卵黄抗体使用效果好(p<0.01)。     

我国猪大肠杆菌病病原型日益复杂

<正>陈祥、赵李祥等通过对从我国部分地区仔猪腹泻或水肿病病猪体内分离到的300个大肠杆菌分离株的O血清型及其毒素、紧密素和黏附素基因进行鉴定,结果显示除50株未定型、17株自凝外,测定出233个分离株的血清型,这些分离株覆盖了45个血清型,其中以0149、0107、0139、093和091为主,共133株,占定型菌株的57.1%;分离株中有51株K88基因阳性(其中菌毛表达率为100%),75株F18基因阳性(其中菌毛表达率为     

鱼源植物乳杆菌表达IPNV VP2-VP3重组蛋白及其口服免疫程序

为比较鱼源乳酸菌表达系统口服疫苗在不同免疫程序下诱导鱼免疫应答水平的差异,确定鱼源乳酸菌表达系统口服免疫虹鳟幼鱼的免疫程序。本研究构建了重组表达IPNV VP2-VP3蛋白的鱼源植物乳杆菌L1212,将重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212包裹颗粒饲料,口服免疫虹鳟幼鱼。免疫程序分为连续免疫组、免疫1 d后间隔1 d再免疫1 d组、连续免疫4 d后32 d加强免疫1次组和间隔免疫后32 d加强免疫1次组。免疫后进行尾动脉采血,间接ELISA方法检测各组血清抗体效价,免疫接种66 d后,腹腔注射IPNV,计算各组相对免疫保护率。确定颗粒饲料按照1 mL/g比例与108 CFU/mL重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212和2.5%海藻酸钠混合,于20℃烘干制备口服疫苗。间隔免疫组血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于其他组,并且免疫2次的间隔免疫组的血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于免疫1次间隔免疫组。采用重组菌包被颗粒饲料饲喂虹鳟幼鱼,间隔免疫的免疫程序和免疫保护率优于连续免疫的免疫程序,对IPNV的入侵起到保护作用。     

仔猪黄白痢病原菌分离与治疗

仔猪黄痢又称早发性大肠杆菌病,1~7日龄仔猪发生的的一种急性、高度危害性的传染病。临床上以仔猪突然拉稀,粪便稀薄如水,呈黄色或灰黄色,迅速脱水为主要特征。已发现的菌毛黏附素主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)。饲养环境卫生条件较差、天气突变、营养缺乏,温度湿度控制差,都会引起仔猪的抵抗力明显下降,容易引起该病的发生。对仔猪黄白痢病原菌分离和治疗进行研究,以指导科学治疗该病。     

一例山羊大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

大肠杆菌存在任何动物的肠道内,大多数于正常情况下是不致病的共栖菌,在特定条件下可致大肠杆菌病。但少数大肠杆菌与人和动物的大肠杆菌病密切相关,它们是病原性大肠杆菌,正常情况下极少存在于健康机体内。根据毒理因子及发病机制的不同,可分为产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、产类志贺毒素大肠杆菌(SLTEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、败血性大肠杆菌(SEPEC)及尿道致病性大肠杆菌(UPEC)。试验通过对一例羊大肠杆菌的分离鉴定,为大肠杆菌病的临床诊治提供有效依据。     

罗非鱼无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗制备及其免疫效果的研究

为研制比无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)单个蛋白抗原免疫效果更佳的多蛋白重组罗非鱼(Oreochromis sp.)链球菌病口服疫苗,该研究利用同源重组法构建表达无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白的pNZ8148-sippgk质粒,通过电转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ9000中获得L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk重组乳酸菌,使用nisin诱导表达并进行Western blot鉴定,制备Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗,通过不同免疫次数隔周免疫的方式灌胃罗非鱼。ELISA检测免疫后的血清抗体水平,在灌胃免疫结束后的第18天通过腹腔注射无乳链球菌攻毒获得相对免疫保护率。结果显示,构建的重组乳酸菌诱导表达的蛋白大小为92 kD,与目的蛋白大小一致。与2次免疫比较,3次免疫该融合蛋白乳酸菌疫苗能显著提高罗非鱼的血清抗体水平和对无乳链球菌的免疫保护效果。3次免疫Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌疫苗的血清水平显著高于单一蛋白组和PBS组,其相对免疫保护率最高(45.56%)。     

嗜水气单胞菌ompA、flaA基因重组干酪乳杆菌对鲤生长及免疫效果分析

为构建嗜水气单胞菌ompA和flaA基因重组干酪乳杆菌并分别检测其表达产物对鲤生长及免疫效果的影响,实验将目的基因克隆至乳酸菌穿梭表达质粒pPG612中,并电转至干酪乳杆菌中,经诱导后包被饲料对鲤进行饲养56 d,称重并采集血清及组织,分析生长指标及免疫指标变化。在56 d饲养免疫结束后结果显示,生长指标显示重组干酪乳杆菌组与对照组无显著差异,表明重组干酪乳杆菌对生长无影响;免疫效果分析显示,血清中IgM表达水平显著上升。血清中AKP、LZM、SOD、CAT、C3和C4也均显著升高。荧光定量PCR检测发现,免疫后肝脏、脾脏、头肾及肠组织中的细胞免疫因子基因IL-1β、IL-8、TNF-α、 NF-κB、 TLR5及MYD88的表达水平有不同程度的显著提升;其中TLR5及MYD88表达量在Lc-mcs-flaA组高于Lc-mcs-ompA组。攻毒后Lc-mcs-ompA与Lc-mcs-flaA组免疫保护率分别为59%与54%,显著高于对照组。研究表明,本实验构建的重组干酪乳杆菌Lc-mcs-ompA与Lc-mcs-flaA免疫鲤能刺激机体产生免疫应答反应,进而提高自身存活率,为预防鱼类嗜...     

红鳍东方鲀3个白介素基因的序列特征及表达分析

本试验分析体质量(190.34±2.13)g的红鳍东方鲀白介素基因IL-1b、IL-8和IL-10的序列特征,检测其在红鳍东方鲀脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏和脾脏中的表达,以及每尾红鳍东方鲀注射密度1×10^7 cfu/mL的哈维氏弧菌菌液0.1 mL后0、12、24、48 h在肝脏和脾脏中的表达。试验结果表明,IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列全长分别为771、822 bp和844 bp。3个基因在健康成鱼脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、脾脏中均有表达,其中肝脏和脾脏表达显著(P<0.05)。感染哈维氏弧菌后12 h,IL-1b基因在肝脏中显著上调,12 h和48 h在脾脏中显著升高(P<0.05)。感染哈维氏弧菌后12 h和24 h IL-8基因在肝脏和脾脏中均显著上调(P<0.05);而感染后24 h和48 h IL-10基因在肝脏中显著升高,在脾脏中12 h和48 h显著升高(P<0.05)。笔者首次探讨红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列特性及表达特征,为研究3个基因的原核表达提供了试验信息,将为进一步深入探究重组蛋白活性及其在红鳍东方鲀健康养殖中的应用奠定基础。     

罗非鱼AMH基因的原核表达及多克隆抗体制备

抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone, AMH)，也称苗勒氏管抑制物质(mullerian inhibiting substance, MIS)，为肽类生长因子，属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用，应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性，选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663 bp的目的序列AMH基因，克隆至T载体中，经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-AMH，并在大肠杆菌BL21中获得了高表达，目的蛋白约占菌体总蛋白的38.7％。菌体经溶菌酶裂解，制备无细胞抽提液，GSTrap FF column柱层析后得到分子量为49 ku单一条带的目的蛋白。目的蛋白经FactorXa酶切裂解，GSTrap FF column过柱纯化后得到纯化的AMH蛋白,分子量为26 ku，浓度为2.6 mg/mL。以每只20 μg的剂量4次免疫ICR小鼠，免疫小鼠可以检测到特异性针对AMH蛋白的血清抗体应答，免疫组抗体水平显著高于空白组(P<0.05)，且加强免疫第5周后抗体效价为0.672±0.411，达到高峰值，血清效价为1∶2 000。试验结果表明表达产物具有免疫原性，可以刺激机体产生免疫应答。     

拟态弧菌外膜蛋白OmpU 基因的原核表达及其免疫保护性研究

自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEx-4T-1-OmpU.将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21进行IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9 kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性.用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×103CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15).表明OmpU是拟态.弧菌的保护性抗原之一,具有研发成为外膜蛋白基因工程亚单位苗的潜在价值.     

猪胎盘丙种球蛋白的制备及对仔猪大肠杆菌性腹泻的防治试验

采取大肠杆菌多价疫苗重复免疫法,收集母猪胎盘,提纯胎盘丙种球蛋白。并进行了仔猪大肠杆菌性腹泻的防治试验。结果:胎盘丙种球蛋白能明显抑制大肠杆菌的生长(P<0.01);能显著增强不吃初乳仔猪的抗感染能力(P<0.05);对大肠杆菌性腹泻的预防效果优于普通球蛋白(P<0.01),治愈率高于痢特灵(P<0.05)。表明猪胎盘丙种球蛋白对仔猪大肠杆菌性腹泻有显著的预防效果和较强的治疗作用。     

鲟鱼硫酸软骨素对小鼠免疫器官肥大细胞的影响

为研究鲟鱼硫酸软骨素对小鼠免疫器官的影响,连续对小鼠灌胃不同剂量鲟鱼硫酸软骨素2周后,外科手术取出胸腺和脾脏,并依次进行称重、卡洛氏固定、石蜡包埋、组织切片、甲苯胺蓝染色,40倍物镜下观察鲟鱼硫酸软骨素对小鼠免疫器官肥大细胞数量的影响。结果表明：鲟鱼硫酸软骨素能促进小鼠免疫器官重量指数增大,并能显著促进免疫器官中肥大细胞数量的增长。其中,600 mg/kg剂量下小鼠胸腺指数显著( P<0．05)增大,胸腺中肥大细胞数量极显著( P<0．01)增加,60 mg/kg剂量下小鼠脾脏重量的增加最为明显( P<0．01),6 mg/kg剂量下小鼠脾脏中肥大细胞数量的增加最为明显( P<0．01)。     

霍乱弧菌TcpA蛋白的表达及其免疫活性分析

采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株（Vibrio cholerae Y1）扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-corcgulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD 18-T载体.序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677).同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6％～ 99.7％和98.7％～ 99.1％,表明TcpA蛋白相当保守.将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为47.0 kD的重组TcpA融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测结果显示,重组TcpA融合蛋白可与鼠抗Vc Y1菌株菌毛蛋白抗血清发生特异性结合反应.用纯化的重组TcpA融合蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)制备抗血清,双相免疫扩散试验检测抗体效价达1:16,且该抗血清能够明显抑制Vc Y1菌株对HEp-2细胞的黏附.草鱼免疫后第25天用Vc Y1菌株攻毒,结果相对免疫保护率达到73.33％.研究结果表明,组TcpA蛋白仍保留着天然菌毛蛋白的免疫原性、免疫反应性和免疫保护性,重组TcpA蛋白可作为霍乱弧菌的候选诊断抗原和疫苗抗原.     

一起牦牛腹泻病的PCR病原学诊断

四川省甘孜藏族自治州理塘县某牧民家的1～3月龄犊牦牛发现腹泻为主症的疾病，传播极快，为查明发病原因，采集了犊牦牛的腹泻粪便样本11份，先用酚-氯仿法和Trizol法提取腹泻粪便的总DNA和RNA,然后用牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、沙门氏菌(Salmonella)和安氏隐孢子虫(C.andersoni)特异的PCR方法进行检测。结果牛轮状病毒检出率为72.7%(8/11),其余病原检测均为阴性。结合临床，明确了该病例中的犊牦牛腹泻主要由牛轮状病毒(BRV)感染引起，为犊牦牛腹泻疾病的针对性防控提供了依据。     

抑制素α基因诱导表达及其多克隆抗体的制备

目的为获得诱导表达的绵羊卵泡抑制素基因蛋白及其多克隆抗体。方法试验首先对绵羊卵泡抑制素α基因原核表达产物进行诱导表达及可溶性分析,其次运用以镍柱亲层析和尿素透析的方法收集其表达蛋白并用弗氏佐剂对其进行乳化,最后将乳化后的蛋白免疫制剂对新疆双峰骆驼进行多次加强免疫,以获得卵泡抑制素α基因多克隆抗体。结果绵羊卵泡抑制素α基因原核表达产物在IPTG诱导作用下呈包涵体形式存在,蛋白纯度较高,免疫后血清抗体效价为5.12×10~6,SDS-PAGE电泳分析结果显示,在39 ku有常规抗体的条带存在,在26 ku处存在纳米抗体的条带。结论绵羊卵泡抑制素α蛋白经纯化后对双峰骆驼免疫可以获得高效价、高纯度的抑制素α多克隆抗体。     

鳗源嗜水气单胞菌β—溶血素基因的克隆及表达

应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。     

罗非鱼罗湖病毒ORF10蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

为了研究罗非鱼罗湖病毒(tilapia lake virus, TiLV) ORF10 蛋白的功能, 从染病莫桑比克罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏和肝脏组织中克隆获得 TiLV ORF10 基因编码序列, 并成功构建了荧光定位载体 pEGFP-ORF10 和重组表达载体 pET32a-ORF10。将荧光定位载体 pEGFP-ORF10 转染鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC), 经荧光显微镜观察, 在 EPC 的细胞核中观察到绿色荧光信号, 表明该蛋白定位于细胞核中。将重组载体 pET32a-ORF10 转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行目的融合蛋白表达, 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明, His-TiLV ORF10 融合蛋白成功表达并主要存在于上清液中。随后, 采用 Ni-NTA 亲和层析的方法纯化融合蛋白 His-TiLV ORF10, 以其为抗原多次免疫 Balb/C 小鼠, 制备多克隆抗体。蛋白印迹法(WB)分析显示, 制备的抗体可以特异性识别 His-TiLV ORF10。利用蛋白印迹法进一步对感染 TiLV 莫桑比克罗非鱼的不同来源组织进行检测, 结果显示, TiLV ORF10 蛋白在染病莫桑比克罗非鱼肌肉、脾脏、肝脏和肾脏中的表达存在较大差异, 其中以肝脏和肾脏组织表达量为最高, 脾脏次之, 肌肉中表达量最低。本研究为深入了解 TiLV ORF10 蛋白的功能和病毒侵染与致病等机理提供了重要基础。     

大菱鲆T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)基因全长cDNA的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏cDNA文库中克隆得到T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)全长cDNA序列.该序列包含193 bp的5'末端非编码区(5'UTR),1 506 bp的开放阅读框(ORF)和300 bp 3'UTR,整个开放阅读框编码502个氨基酸.系统发生分析表明,大菱鲆LCK基因与红鳍东方纯(Fugu rubripes)和黑青斑河纯(Tetraodon nigroviridis)的亲缘关系最近.在大菱鲆正常组织、胚胎细胞(TEC)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的免疫器官组织中对LCK基因进行了RT-PCR表达分析.结果表明,大菱鲆LCK基因只在正常脾脏组织中表达;在用鳗弧菌感染12 h后,大菱鲆胚胎细胞LCK基因表达增强;在鳗弧菌感染的大菱鲆免疫组织中,只在脾脏中检测到LCK基因表达,鳗弧菌感染48 h后,LCK基因在脾脏中表达最强.这些结果表明,LCK基因在大菱鲆脾脏免疫应答中起着重要作用.     

尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果

链球菌病是威胁我国罗非鱼养殖产业健康发展的重要病害之一。为研制出免疫效果好、操作简便的罗非鱼链球菌病疫苗,本研究构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的穿梭质粒pNZ8124-Sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸菌活菌载体疫苗。采用SPS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测;利用不同浓度的重组乳酸菌活载体疫苗灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化,通过人工腹腔注射感染无乳链球菌获得相对免疫保护率。研究结果显示,构建的重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48 ku特异性蛋白,与目的蛋白大小一致;PAGE电泳显示,重组蛋白主要以可溶蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。口服免疫结果显示,中浓度组(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度组(2.24×10~9 CFU/mL)免疫2次能够显著提高尼罗罗非鱼的血清抗体水平和抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) CD59基因的原核表达与功能探究

本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式.结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高.对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59.该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好.Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达.对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功.选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白pET-32a-CD59的抑菌活性.研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性.本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础.