罗非鱼无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗制备及其免疫效果的研究

为研制比无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)单个蛋白抗原免疫效果更佳的多蛋白重组罗非鱼(Oreochromis sp.)链球菌病口服疫苗,该研究利用同源重组法构建表达无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白的pNZ8148-sippgk质粒,通过电转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ9000中获得L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk重组乳酸菌,使用nisin诱导表达并进行Western blot鉴定,制备Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗,通过不同免疫次数隔周免疫的方式灌胃罗非鱼。ELISA检测免疫后的血清抗体水平,在灌胃免疫结束后的第18天通过腹腔注射无乳链球菌攻毒获得相对免疫保护率。结果显示,构建的重组乳酸菌诱导表达的蛋白大小为92 kD,与目的蛋白大小一致。与2次免疫比较,3次免疫该融合蛋白乳酸菌疫苗能显著提高罗非鱼的血清抗体水平和对无乳链球菌的免疫保护效果。3次免疫Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌疫苗的血清水平显著高于单一蛋白组和PBS组,其相对免疫保护率最高(45.56%)。     

罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性

为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-Tag单抗特异性结合;制备的亚单位疫苗免疫鱼体后第14天即可检测到抗体产生,并在第28天达到峰值,抗体效价为1∶4096,免疫保护率为70%。由此证实,该亚单位疫苗有望成为预防由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病的基因工程类疫苗。     

罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的原核表达及免疫原性分析

LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示,诱导表达蛋白的分子量为108.9 ku,并且该重组蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。经His Bind亲和柱纯化及超滤管浓缩后,LrrG可溶蛋白浓度达3.40 mg/mL。鱼体注射免疫实验表明,LrrG可溶蛋白对罗非鱼的相对免疫保护率达69.28%,且免疫后4周的血清抗体滴度为1∶800。该研究为深入探讨无乳链球菌LrrG蛋白作为罗非鱼基因工程疫苗的潜在应用价值奠定了基础。     

罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究

为探究无乳链球菌LrrG(Leucine-rich repeat protein from GBS)和表面免疫原性蛋白Sip(surface immunogenic protein)串联表达的LrrG-Sip重组融合蛋白的免疫原性,该研究将原核表达的LrrG-Sip重组融合蛋白分别以0.5μg·g~(-1)(R1组)、1.0μg·g~(-1)(R2组)和1.5μg·g-1(R3组)每尾200μL腹腔注射免疫尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus),同时以Sip蛋白(S组)、LrrG蛋白(L组)以及PBS(P组)作为对照。2周后对所有免疫鱼体进行无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)人工攻毒,攻毒剂量为其半致死浓度(LD_(50):4.0×108CFU·mL~(-1))。结果显示LrrG-Sip重组融合蛋白R1组对尼罗罗非鱼的相对免疫保护率最高,达89.14%;且免疫后第14和第28天,该组鱼体血清抗体OD_(450nm)值分别达0.63和0.64,均显著高于单一蛋白对照组(S和L组)和PBS组(P0.05);R1组鱼体血清过氧化物酶(POD)和碱性磷酸酶(AKP)活性在上述2个时间点也显著高于其他组(P0.05);但溶菌酶(LZM)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性与其他组之间差异不显著(P0.05)。初步表明LrrG-Sip重组融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫原性明显优于单个蛋白,且能有效减少免疫剂量。     

罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达

LrrG和表面免疫原性蛋白（Sip）是无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的2种表面蛋白,具有良好的免疫原性。为获得罗非鱼无乳链球菌表面蛋白LrrG和Sip蛋白的融合蛋白,该试验采用基因拼接技术中的双酶切法分2步逐个将Sip和LrrG基因插入pColdⅡ载体中,构建原核表达载体pColdⅡ-LrrG-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞BL21（DE3）,进行诱导表达条件的优化。结果显示,15℃、IPTG 0.5 mmol·L-1诱导9 h,目的蛋白呈可溶状态的表达量最高。Western Blot检测结果显示LrrG-Sip融合蛋白大小与预测一致（162kDa）,说明成功构建了融合基因,为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

BALB/c小鼠用于评价尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的研究

实验采用BALB/c小鼠作为实验动物,旨在建立尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力测定的BALB/c小鼠模型。BALB/c小鼠经腹腔注射尼罗罗非鱼源无乳链球菌建立感染模型,比较了尼罗罗非鱼源无乳链球菌分别感染尼罗罗非鱼和小鼠的LD_(50)差异,分别测定了不同毒力尼罗罗非鱼无乳链球菌对尼罗罗非鱼和小鼠的毒力。结果显示,小鼠经腹腔注射无乳链球菌,在24 h内出现死亡现象,且对小鼠脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织造成损伤。3次测定尼罗罗非鱼无乳链球菌TFJ0901对尼罗罗非鱼和小鼠LD_(50)分别为7.7×10~7、2.2×10~8、3.5×10~9 CFU/mL和405、361、419 CFU/只。将无乳链球菌TFJ0901和THN0901感染尼罗罗非鱼(1.0×10~7 CFU/mL)和小鼠(100 CFU/只),尼罗罗非鱼和小鼠存活率分别为100%、6.7%±5.8%和100%、0,其存活率都具有显著性差异。将无乳链球菌TFJ0901和TFJ-F感染尼罗罗非鱼(3.0×10~8 CFU/mL)和小鼠(2 500 CFU/只),尼罗罗非鱼的存活率分别为73.3%±11.5%和80.0%±10.0%,存活率差异不显著,小鼠存活率分别为13.3%±11.5%和100.0%,存活率具有显著性差异。研究表明,本实验成功建立了BALB/c小鼠作为尼罗罗非鱼源无乳链球菌毒力测定的稳定模型,测定不同毒力的尼罗罗非鱼源无乳链球菌对小鼠毒力与对尼罗罗非鱼毒力一致,且该模型能够区分尼罗罗非鱼模型难以区分的毒力相近的无乳链球菌。     

异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果

为了研究异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫罗非鱼后的免疫效果, 本研究采用 10%甲醛溶液灭活法制备了无乳链球菌 HN0901 和 GX1101 胞外产物灭活疫苗, 通过腹腔注射途径免疫健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×O.aureus♂), 在免疫后 28 d 用同/异源无乳链球菌攻毒, 测定了免疫后和攻毒后罗非鱼的免疫应答反应和血清抗体效价, 并比较了罗非鱼在腹腔注射 1×108 CFU/尾无乳链球菌后的相对免疫保护率和交叉免疫保护率。 结果显示, 免疫鱼谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)在免疫后 28 d 显著高于对照组, 但在攻毒后显著低于对照组; 与对照鱼相比, 免疫鱼的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平在免疫和攻毒后均有不同程度的提高, 丙二醛(MDA)显著降低(P＜0.05)。实时定量 PCR 结果显示, 炎性细胞因子基因 TNF-α、IL-1β 和 TGF-β, 体液免疫相关基因 HSP70, MHC Ⅱ和 IgM 在免疫和攻毒后也呈现显著升高趋势, 并显著高于对照组(P＜0.05)。血清抗体效价于免疫后第 28 天达到 1∶6400, 显著高于对照组(P＜0.05)。攻毒实验结果显示, 免疫组在同源和异源无乳链球菌攻毒后相对的免疫保护率在 31.6%~47.4%。结果表明, 研制的灭活疫苗免疫罗非鱼后, 能够显著诱导罗非鱼体内的免疫应答, 产生中等疫苗效力, 对同/异源无乳链球菌都具有免疫保护能力。本研究结果为深入研究罗非鱼链球菌病的免疫预防技术和研制二价疫苗奠定了基础。     

无乳链球菌LIP蛋白的截短表达及免疫保护性研究

为评价罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)BX2012株脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性及其对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的保护效果,以无乳链球菌脂蛋白基因序列(GenBank序列号:CP000114.1,SAK_0321)的B细胞线性抗原表位区设计特异性引物进行扩增,构建重组表达载体,将截短表达的脂蛋白制备成亚单位疫苗,同时制备灭活疫苗进行免疫比对。结果显示:重组表达载体p ET-32a-LIP342在BL21(DE3)中获得了良好的可溶性表达,分子质量约为30 kDa,纯化使LIP342纯度由41.75%提至87.23%;Western blotting分析显示,LIP342可被兔抗无乳链球菌高免血清特异性识别;LIP342在目前已知不同种属来源或不同血清型的无乳链球菌分离株中同源性为90.35%~100%,在罗非鱼源分离株中同源性为100%;无乳链球菌LIP342蛋白和灭活疫苗均可显著提升奥利亚罗非鱼和大菱鲆血清抗体水平,而LIP342诱导的血清抗体水平均显著高于灭活疫苗;经0.1 mL 1×10~9cfu/mL的无乳链球菌攻毒后,LIP342蛋白和灭活疫苗对供试鱼的累积存活率均显著高于PBS对照组。结果表明,高度保守的LIP342具有较好的免疫原性,可作为无乳链球菌亚单位疫苗候选因子。     

鱼源植物乳杆菌表达IPNV VP2-VP3重组蛋白及其口服免疫程序

为比较鱼源乳酸菌表达系统口服疫苗在不同免疫程序下诱导鱼免疫应答水平的差异,确定鱼源乳酸菌表达系统口服免疫虹鳟幼鱼的免疫程序。本研究构建了重组表达IPNV VP2-VP3蛋白的鱼源植物乳杆菌L1212,将重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212包裹颗粒饲料,口服免疫虹鳟幼鱼。免疫程序分为连续免疫组、免疫1 d后间隔1 d再免疫1 d组、连续免疫4 d后32 d加强免疫1次组和间隔免疫后32 d加强免疫1次组。免疫后进行尾动脉采血,间接ELISA方法检测各组血清抗体效价,免疫接种66 d后,腹腔注射IPNV,计算各组相对免疫保护率。确定颗粒饲料按照1 mL/g比例与108 CFU/mL重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212和2.5%海藻酸钠混合,于20℃烘干制备口服疫苗。间隔免疫组血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于其他组,并且免疫2次的间隔免疫组的血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于免疫1次间隔免疫组。采用重组菌包被颗粒饲料饲喂虹鳟幼鱼,间隔免疫的免疫程序和免疫保护率优于连续免疫的免疫程序,对IPNV的入侵起到保护作用。     

无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗的制备及免疫效果评价

为了研究无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护作用,本研究通过PCR和重叠延伸拼接技术(SOEing)获得融合基因Sip-GAPDH,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)制备DNA疫苗,通过背鳍肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼,免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip-GAPDH在各个组织(包括肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏)中的表达情况。采用ELISA、Real-time PCR法和体外攻毒法分别分析各实验组不同时间血清抗体效价、免疫基因(IgM、IL-1β和CD8)表达变化规律和相对保护率,研究该嵌合性疫苗对吉富罗非鱼的保护效果。结果显示,实验组在免疫接种第7和第28天时,注射点周围的肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏均能检测到嵌合性质粒,实验组罗非鱼血清抗体效价均高于对照组并于21 d时达到峰值(1∶4 096);qPCR数据表明,实验组鱼体胸腺、头肾和脾脏的IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调,并且在胸腺、头肾和脾脏中的表达量分别在免疫后第12和第48 h达到峰值;免疫后42 d进行人工攻毒后计算免疫保护率为93.3%。以上研究结果表明,本研究构建的无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗在罗非鱼链球菌病防治中具有潜在的应用价值。     

尼罗罗非鱼肠道及养殖环境中菌群结构与链球菌病的相关性

为研究尼罗罗非鱼肠道和池塘养殖环境中菌群结构变化与链球菌病暴发的相关性,实验采用16S r DNA高通量测序方法对比分析发病和健康池塘水体、底泥和尼罗罗非鱼肠道菌群的结构特征。结果显示,底泥中微生物多样性最高,水体和肠道中微生物多样性次之;肠道菌群与水体中菌群的相似性较高,而与底泥中菌群相似性较低;发病组的尼罗罗非鱼肠道和池塘底泥中微生物的多样性均低于健康组,而发病组池塘水体中微生物多样性高于健康组。OTU聚类分析发现,发病与健康尼罗罗非鱼肠道微生物差异极显著,大部分健康尼罗罗非鱼肠道微生物样品单独聚为一支。菌群结构组成分析结果表明,虽然发病组和健康组水体或底泥中优势菌群结构组成的差异较小,但在非优势菌群中存在一定差异,发病组水体中变形菌门和梭杆菌门的比例显著高于健康组水体,疣微菌门和浮霉菌门的丰度显著低于健康组水体;发病组池塘底泥中厌氧粘细菌属、甲烷丝菌属和枝芽孢菌属等具有降解有机质和生态修复功能,菌群的丰度显著低于健康组底泥,而具有致病能力的曼氏杆菌属丰度却显著高于健康组底泥。发病组尼罗罗非鱼肠道菌群中链球菌属、分枝杆菌属和曼氏杆菌属等致病菌群的丰度显著高于健康组尼罗罗非鱼肠道,而乳球菌属、鲸杆菌属和红球菌属等益生菌的丰度显著低于健康尼罗罗非鱼肠道。无乳链球菌普遍存在于发病和健康养殖环境,以及尼罗罗非鱼肠道中,无乳链球菌的丰度在发病和健康养殖环境之间无显著差异,但其在发病尼罗罗非鱼肠道中的丰度要显著高于健康组。研究表明,尼罗罗非鱼链球菌病发病池塘水体和底泥中有益菌丰度降低和致病菌丰度的升高反映其养殖环境出现恶化,尼罗罗非鱼链球菌病的暴发与肠道微生态平衡破坏后无乳链球菌丰度增加密切相关,但肠道中无乳链球菌丰度的剧增与养殖水体和底泥中该病原菌的丰度水平之间并无直接关联。     

cel-EIIB蛋白调控罗非鱼无乳链球菌强毒、弱毒株毒力相关基因的表达模式

罗非鱼无乳链球菌纤维二糖-磷酸转移酶系统（cel-PTS）的EIIB蛋白对强毒株毒力影响有限，但对弱毒株毒力似乎存在潜在的影响，但具体机制仍不清晰，有必要弄清该蛋白调控强、弱毒株的毒力相关基因表达模式。在前期研究中，通过同源重组技术，构建了无乳链球菌强毒株cel-EIIB基因缺失株，本研究通过类似的方法，获得弱毒株该基因的缺失株。用无乳链球菌强毒、弱毒株及它们的cel-EIIB缺失株分别感染斑马鱼，结果显示，cel-EIIB缺失后，导致弱毒株毒力明显返强，而强毒株毒力则轻微减弱。qPCR检测发现，cel-EIIB缺失可致cel-PTS系统的cel-EIIA、双组分信号转导系统（TCS）的DltR和CiaH以及毒力基因sodA、cpsD和cpsG在强、弱毒株中呈现相反的表达模式；此外，TCS系统的RgfC、DltS和CsrR以及毒力基因cspA和pavA在强毒突变株中表达未受影响，但在弱毒突变株中的表达却显著上调。研究揭示，EIIB蛋白可能通过调控上述毒力相关基因表达而负调控弱毒菌株的毒力。     

灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响

为探究灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响,用1×10~6、1×10~7、1×10~8个/mL 3个浓度的灿烂弧菌刺激厚壳贻贝,探讨弧菌刺激后厚壳贻贝的一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)等免疫指标和淀粉酶、蛋白酶等消化酶的变化情况。结果显示,灿烂弧菌刺激48 h后,厚壳贻贝足、鳃、消化腺等组织中仅消化腺的NOS活性较对照组有显著升高,且酶活性随初始细菌浓度的升高而升高,故选用消化腺来测定灿烂弧菌刺激后72 h内的免疫指标和消化酶活性的变化。灿烂弧菌刺激后,48 h内NOS活性较对照组均显著升高。NO含量较对照组均显著升高,与NOS显现相同变化趋势。SOD活性在各浓度灿烂弧菌刺激下较对照组均显著升高,而MAD含量在实验组中含量显著低于对照组。淀粉酶活性在实验组中显著低于对照组,总体呈现先下降后升高的趋势。蛋白酶活性在各实验组中均呈现先升高后下降的趋势。研究表明,灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和蛋白酶活性的升高有诱导作用,但对蛋白酶的活性有抑制作用。本研究初步探明了厚壳贻贝对灿烂弧菌的免疫应答机制,为进一步研究灿烂弧菌和厚壳贻贝相互作用机制以及厚壳贻贝免疫机制奠定了基础。     

魁蚶各组织溶菌酶活性对鳗弧菌侵染的响应

为了有效防治细菌及其他病原微生物对魁蚶等贝类的危害,本实验研究了魁蚶各组织中溶菌酶活性对鳗弧菌侵染的响应过程,以期探讨魁蚶体内溶菌酶的免疫功能。本实验采用注射活菌的方法侵染20月龄魁蚶个体,随机选取16只个体,在每只个体的斧足处注射1 mL(约1×10~9个)鳗弧菌菌悬液作为感染组;随机选取16只个体不注射鳗弧菌作为对照组。两组魁蚶分别于洁净海水中暂养4、12、24和48 h后,每组随机取4只魁蚶个体的血液、外套膜、鳃、斧足、肝胰腺和闭壳肌等组织,采用ELISA试剂盒测定其溶菌酶含量变化。结果显示,对于鳗弧菌的侵入,魁蚶血液中溶菌酶含量由正常低值迅速增高并一直维持较高的含量,说明血液是魁蚶机体防御病原菌的主要免疫组织之一;魁蚶外套膜在无感染的情况下,对外界水环境的干扰始终保持较高的溶菌酶含量;鳃、斧足的溶菌酶含量均在注射细菌24 h之后明显高于正常值,说明外套膜、鳃、斧足作为魁蚶机体与外界接触的第一道屏障也能应对病原菌入侵,但反应较血液延迟;肝胰腺和闭壳肌的溶菌酶含量变化不明显,推测肝胰腺和闭壳肌不是魁蚶的重要免疫组织或器官。本实验结果可为魁蚶抗病选育及免疫机理方面的研究提供相关的参数。     

引起养殖许氏平鲉死亡的鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及致病性

从患病许氏平鲉的病灶处分离得到一株优势菌,记为SS-1。通过两点背部肌肉注射进行人工感染实验,证明该菌对健康许氏平鲉的半数致死浓度为9.6×106CFU/mL,可感染许氏平鲉的多种内脏和组织。细菌形态学和生理生化特征测定结果显示,菌株SS-1为革兰氏阴性,短杆状,极生单鞭毛;氧化酶阳性、接触酶阳性、硝酸盐还原阳性、吲哚产生阳性、V-P试验阳性、精氨酸双水解酶阳性、H2S产生阴性等,与鳗利斯顿氏菌特征相符。16S rRNA基因序列分析结果表明,该菌与鳗利斯顿氏菌的同源性达到了99%,因此,将菌株SS-1鉴定为鳗利斯顿氏菌。     

珠江口海域双胞旋沟藻赤潮对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性

为研究2009年10月下旬在广东珠海海域爆发的双胞旋沟藻赤潮对养殖鱼类及水体中其它生物的影响,实验以卤虫幼体、金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗作为受试生物,在赤潮现场测试双胞旋沟藻对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性效应。结果显示,24 h双胞旋沟藻对卤虫幼体的LC₅₀(半致死浓度)为9.55×10⁴/mL,藻密度为2.5×10³/mL的双胞旋沟藻对卤虫幼体的LT₅₀(半致死时间)为48.5 h。60 h内该赤潮水体对鱼苗和虾苗的存活无不利影响,卤虫幼体和金鼓鱼苗均可摄食双胞旋沟藻,卤虫幼体对双胞旋沟藻的摄食率低。研究表明,双胞旋沟藻赤潮水体对卤虫幼体有一定的毒性作用,但在低藻密度条件下,卤虫幼体能以该藻为食并维持其生命,双胞旋沟藻对金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗无急性毒性作用。     

美洲鳗鲡致病性鲍曼不动杆菌的分离、鉴定及致病性分析

为确定海南某鳗鲡养殖场患病美洲鳗鲡大量死亡的原因,从患病美洲鳗鲡肝脏和脾脏中分离获得1株优势菌株AB01,回归感染证实该菌株为导致此次美洲鳗鲡患病的病原菌。经生理生化鉴定、16S rDNA基因序列比对及系统发育分析,判定菌株AB01为鲍曼不动杆菌。致病性分析结果显示,菌株AB01对美洲鳗鲡的半致死浓度为4.63×106CFU/mL。组织病理学观察显示,患病美洲鳗鲡的肝脏、脾脏均发生不同程度的病变,其中,肝脏中部分肝索排列紊乱,细胞肿胀,胞核溶解,胞质疏松,结构模糊,有大量大小不等的空泡;脾脏中胞质多处稀疏,伴有大面积损伤。药敏检测显示,鲍曼不动杆菌AB01对头孢噻吩、头孢唑啉、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、利福平、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星敏感,对氟苯尼考、氨苄西林等9种抗生素中度敏感,对氨曲南和四环素等20种抗生素有多重耐药性。     

巨须裂腹鱼水霉菌的分离鉴定及其对脾脏转录组的影响

为分析感染水霉菌对巨须裂腹鱼脾脏转录组的影响，探索水霉菌感染巨须裂腹鱼的分子机制，实验随机选取生活在同一水域中的5尾健康和5尾感染水霉菌的巨须裂腹鱼，采用PDA琼脂培养基和分子生物学方法对巨须裂腹鱼水霉菌进行分离鉴定，并采用Illumina HiSeqTM 2000 高通量测序平台，对健康和感染水霉菌的巨须裂腹鱼脾脏组织进行转录组测序，并对测序数据进行拼接、注释和差异表达基因分析。结果显示，从巨须裂腹鱼皮肤上分离鉴定得到3株水霉菌；转录组数据显示，健康组和感染水霉病组分别获得46 619 504 条和43 912 876 条数据，与健康组相比，感染水霉菌组共有1 889 个基因发生差异表达，其中1 414 个基因上调，475 个基因下调，随机选取6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证，验证结果与转录组测序一致。对健康组和感染水霉菌组的差异表达基因进行GO功能富集发现，上调基因主要富集于241个功能中，下调基因主要富集于60个功能中，上述基因主要涉及分子功能类、细胞组分类和生物过程类等生理功能；KEGG通路富集分析发现，差异表达基因主要富集在免疫疾病、内分泌和代谢疾病、病毒感染性疾病、消化系统及排泄系统等。研究表明，感染水霉菌会影响巨须裂腹鱼脾脏组织多种基因的表达量，实验结果为进一步探索巨须裂腹鱼水霉菌的感染机制奠定了基础。     

EGCG对尼罗罗非鱼肌原纤维蛋白降解的抑制作用

为研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对尼罗罗非鱼肌原纤维蛋白在贮藏过程中降解的抑制作用,实验采用质量分数为0.002 5%、0.01%、0.02%、0.03%的EGCG对罗非鱼肌肉进行处理,考察不同浓度EGCG对贮藏过程中罗非鱼肌肉肌原纤维蛋白盐溶性的影响,并采用SDS-PAGE凝胶电泳结合质谱技术筛选EGCG抑制降解靶向蛋白质。结果显示,实验条件下不同浓度的EGCG对肌原纤维蛋白降解均有抑制作用,质量分数为0.01%的EGCG抑制效果最佳,肌原纤维蛋白质含量由贮藏初期的(82.42±0.65)降至第12天的(51.89±0.68)mg/g(下降率37.0%),而对照组由(80.86±1.18)降至(35.33±1.16)mg/g(下降率56.3%)。研究表明,通过SDS-PAGE凝胶电泳及质谱技术鉴定,EGCG对尼罗罗非鱼肌原纤维蛋白降解的抑制作用靶向蛋白质分别为MHC、MLC与肌动蛋白,本结果对罗非鱼冷藏保鲜研究具有一定指导意义。