异育银鲫咽碘泡虫病组织病理与病理生理

咽碘泡虫(Myxobolus pharynae)病是近几年发生在江苏省盐城地区的大丰、射阳和滨海以及周边地区,引起养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio)大批死亡的一种黏孢子虫病,咽碘泡虫只特异地寄生在异育银鲫的咽部组织内,为了阐明该病对鱼体的损伤作用,我们对不同患病时期的异育银鲫的组织病理和疾病中期的病理生理进行研究。组织病理结果表明:疾病初期病鱼咽部略有轻度充血,咽碘泡虫以营养体阶段寄生在咽部黏膜下层的组织中,并开始形成由成纤维细胞包裹的小孢囊,其他组织器官无病理损伤现象;疾病中期由于小孢囊数量增加和囊内营养体分裂增殖并逐步发育为成熟孢子后体积增大,构成的大孢囊使咽部显著膨大,包裹小孢囊的结缔组织囊壁充血,逐步萎缩而变薄,成纤维细胞核固缩坏死,咽部黏膜层中的上皮细胞淡染、核固缩坏死,味蕾失去应有的结构,鳃组织细胞在鳃小片间严重增生,肾部分区域出现细胞坏死,肾小球肿胀,肾小管上皮细胞出现滴状玻璃样变性,肝、脾、肠和前肾无病理变化现象;疾病后期小孢囊囊壁、黏膜下层和黏膜层组织细胞进一步坏死崩解,出现孔洞,成熟孢子、坏死组织和血液一并流出孔洞,病鱼肠腔中有许多来自坏死的咽部组织细胞和成熟孢子,其他组织器官病理变化与疾病中期相似。疾病中期病鱼的病理生理分析结果表明:病鱼红细胞数量和大小、血红蛋白浓度、血栓细胞数量、血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、血糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶都分别极显著低于健康鱼(P0.01),出现贫血;病鱼红细胞脆性、白细胞数、嗜中性粒细胞数、单核细胞数、总胆红素、肌酐、尿素和乳酸脱氢酶分别都极显著高于健康鱼(P0.01);淋巴细胞数和嗜酸性粒细胞数与健康鱼相比,无显著差异(P0.05)。由于咽碘泡虫的寄生部位鱼咽部严重膨大堵塞口咽腔并引发鳃组织增生、肾的损伤和贫血等变化,进一步发展为咽部组织坏死破裂出现孔洞流血,导致病鱼无法摄食和呼吸困难等功能障碍而死亡。     

框镜鲤肠管单极虫病的组织病理学分析及分子鉴定

2017年6月，四川德阳某养殖场的框镜鲤患病且大量死亡。主要症状为腹部膨大，肠管有大小不等的肿物。为明确其死亡病因，进行了细菌学、寄生虫形态学观察，组织病理学和PCR检测。细菌学检查为阴性；病理组织学观察发现肠道的损伤最为严重，表现为有大量寄生虫样孢囊突出于肠管。寄生虫形态学观察可见孢子长约23~30 μm，宽10~15 μm，极囊长11~15 μm，呈长卵圆形，约占孢子长的1/3~1/2，孢子外面被有一层无色透明的薄膜，前端孢子质中有一个大核和两个小核，与单极虫形态一致；针对吉陶单极虫的18S SSUrRNA基因进行巢式PCR检测，扩增出大小为716 bp的目的片段(命名为TKF-1)，目的条带的测序和序列分析结果表明其为吉陶单极虫。根据组织病理特点及PCR检测结果确认框镜鲤的死亡是感染吉陶单极虫所致。     

散鳞镜鲤皮肤囊肿病病原的分离与鉴定

<正>吉陶单极虫隶属于后生动物亚界,粘体动物门,粘孢子纲,双壳目,单极虫科,单极虫属。目前,已报道单极虫属种类约100余种,主要寄生于淡水鱼类,少数种类可寄生于海水鱼类当中。绝大部分种类不会导致鱼类疾病,仅少数几种单极虫会导致鱼类的大量死亡,如寄生于异育银鲫皮肤的“肤孢子病”武汉单极虫、寄生于异育银鲫鳃上的“鳃孢子虫病”汪氏单极虫以及寄生于鲤或散鳞镜鲤肠道或皮肤的吉陶单极虫等。     

洪湖碘泡虫在发病和隐性感染异育银鲫组织器官中的分布

为探究洪湖碘泡虫在被感染异育银鲫不同组织器官中的分布及不同感染阶段的差异，实验采用显微镜镜检、PCR检测及组织病理切片相结合手段，对发病及隐性感染异育银鲫的肌肉、伪鳃、鳃、头肾等11个组织器官进行了广泛检测分析。显微镜镜检发现，在发病鱼的咽、伪鳃和鳃能观察到孢囊或成熟孢子；在隐性感染异育银鲫的咽上壁与副蝶骨间结缔组织、伪鳃及其血管周边观察到大量棕黄色结节，并含有洪湖碘泡虫的成熟孢子。不同组织器官DNA样品PCR检测发现，在发病鱼除肌肉外的其他10个组织器官中均检测到洪湖碘泡虫存在，其中伪鳃检出率最高(100%)；隐性感染异育银鲫在咽上壁组织、伪鳃、头肾、体肾、脾脏及卵巢中检出洪湖碘泡虫，伪鳃检出率也为最高(26.7%)。组织病理切片显示，发病鱼咽上壁内分布着大量蜂巢状孢囊及成熟孢子，伪鳃被严重侵占和破坏；残存伪鳃鳃丝周边能观察到增殖和发育阶段的孢子生成细胞。综上所述，本研究首次报道了洪湖碘泡虫在发病和隐性感染异育银鲫不同组织器官中的分布差异，发现伪鳃可能是洪湖碘泡虫寄生和发育成熟的重要器官。结果为洪湖碘泡虫病的准确检验检疫和进一步开展致病机制研究奠定基础。     

梭子蟹肌孢虫的组织分布与形式特点

利用透射电镜技术研究了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和形式特点,结果显示,梭子蟹肌孢虫主要寄生在骨骼肌、血淋巴、鳃、胃和肠,而在心脏、肝胰腺、性腺和神经等部位未发现。在胃和肠的结缔组织以及骨骼肌中发现梭子蟹肌孢虫的分裂体,表明其可以在这些组织的细胞中增殖,尤其是在骨骼肌细胞中,大量不同发育时期的虫体显示了该虫对骨骼肌的亲嗜性。梭子蟹肌孢虫的分裂体以及其他增殖期的细胞仅寄生于宿主细胞内,而成熟的孢子可存在于宿主细胞内和细胞外基质中。梭子蟹肌孢虫的孢子有6种存在形式,在宿主细胞内和宿主细胞外基质中各有3种。孢子在宿主细胞内的存在形式:1孢子直接寄生于宿主细胞质中,自由游离,无膜包围;2孢子被单层膜包围,类微绒毛样突起物部分溶解,这种情况见于专业性吞噬细胞——无颗粒细胞内;3孢子被层状环形膜结构包围,类微绒毛样突起物清晰,这种情况见于非专业性吞噬细胞内。孢子在宿主细胞外基质中的存在形式:1孢子自由游离,无膜包围,类微绒毛样突起物清晰;2多个孢子被体液性被囊包围,类微绒毛样突起物清晰;3孢子无膜包围,孢外壁与类微绒毛样突起物消失。本研究阐明了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和孢子的存在形式,为进一步研究微孢子虫在宿主蟹体内的迁移规律提供了重要的基础数据。     

鳜鱼尾孢虫病的综合防治

一、流行情况鳜鱼尾孢虫病是由原生动物门、孢子虫纲的尾孢虫寄生于鱼鳃所引起的一种疾病，一般危害鱼苗、鱼种。２００１年此病在苏南、苏北鳜鱼养殖的鱼塘中都有发现。有的鳜鱼池发病率与死亡率高达６０％～７０％。如放养前清塘不彻底、水体交换差、水质肥、水草少，发病率、死亡率则更高，给养殖户造成较大的经济损失。笔者对洪泽湖的成子湖几家鳜鱼养殖户调查发现，该病主要在５～９月份发病，７～８月份病鱼死亡率高，１１月份还发现病鱼鳃上有胞囊，胞囊中的孢子成熟后，大胞囊壁内发生纤维素样变，胞囊破裂、孢子释放，最后大胞囊萎…     

武汉单极虫生活史中放射孢子虫的发现及鉴定

鲫养殖中粘孢子虫病非常严重,为掌握其病原的感染传播途径,实验通过粘孢子虫生活调查研究,在底栖寡毛类苏氏尾鳃蚓体内发现了一种放射孢子虫。该放射孢子虫的孢子无孢柄;孢体顶面观和侧面观都呈近卵圆形,长(19.8±1.3)μm,宽(18.2±1.1)μm;3个极囊梨形,呈点状聚集分布在孢体顶端,极囊长(4.53±0.4)μm,宽(3.4±0.4)μm;3个尾柄几乎等长,刺状,从孢体基部向下伸展,尾柄间夹角100°,尾柄长(195.0±15.7)μm,宽(11.5±0.8)μm。根据形态特征将其划归为橘瓣放射孢子虫集合类群。18S r DNA序列分析表明该放射孢子虫与鲫体表寄生武汉单极虫为同一物种,序列相似率为99.8%~100%。序列系统发育分析进一步发现单极虫类群中多数种类的放射孢子虫阶段主要寄生在苏氏尾鳃蚓体内。本研究首次发现和报道了鲫寄生武汉单极虫生活史中寡毛类宿主及其放射孢子虫的形态特征,为鲫粘孢子虫病生态防控提供重要的基础资料。     

鳜肤孢虫新种的分离和鉴定

为准确鉴定鳜肤孢虫病的病原,实验基于形态学比较,结合寄生特征分析和分子系统学方法开展研究,并观察超微结构。形态学观察结果显示,纺锤形或哑铃形白色孢囊,长约1.9～6.8 mm,寄生于鳍条、皮肤、口腔、鳃盖内外表面和鳃丝;圆形内生孢子,直径约(9.8±1.8)(7.3～13.8)μm;孢子内环状细胞质和直径约(6.5±1.2)(3.9～8.3)μm的圆形折光体,鉴定其为肤孢虫。该物种测量值区别于其他肤孢虫,与寄生于鳜鳃的未定种(HB)测量值基本一致;与广东省和河南省的鳜源鳗鲡肤孢虫(GD和HN)以及HB寄生于相似部位。分子序列比对和系统发育结果显示,该物种与GD、HN、芬兰肤孢虫、鲑肤孢虫和寄生美洲鳗鲡的鳗鲡肤孢虫序列的一致性大于99%;与GD和HN的亲缘关系最近,与鲑肤孢虫次之,与芬兰肤孢虫和鳗鲡肤孢虫的亲缘关系较远。综上,该物种与已报道的寄生与鳜的肤孢虫为同种,并修订寄生鳜的鳗鲡肤孢虫的GD和HN分离株记录;将本研究肤孢虫和HB、GD和HN分离株一同命名为鳜肤孢虫(Dermocystidium sinipercae sp. n.),新种。鳜肤孢虫种内形态差异可能与采样时间和发育阶段有...     

养殖大黄鱼一种黏孢子虫病的组织病理学及检测方法初探

运用组织病理切片、电镜观察及PCR扩增等方法对2017年在舟山采集到的临床表现"白鳃"症状的发病大黄鱼(Larimichthyscrocea)开展了病原学及快速检测方法的初步研究。组织病理观察显示,患病鱼的肝、脾、肾等内脏组织发生严重的病理变化,尤其是组织内红细胞发生明显的退行性变化,同时血液中红细胞数量显著减少。在病鱼组织的电镜超薄切片中可观察到直径约300～600 nm的孢子虫样结构。提取病鱼内脏组织总基因组DNA样本,采用1对针对寄生原虫的通用引物进行SSUrDNA的PCR扩增,最终获得大小为1471bp的特异性条带,经测序比对发现,该条带与GenBank中1种黏孢子虫Sinuolinea sp.的序列同源性最高,达89%。根据获得的SSU rDNA序列,建立了适用于该病临床检测的巢式PCR方法,最小灵敏度可达0.5 pg。研究表明,引起此次网箱养殖大黄鱼"白鳃"症状并导致鱼类大量死亡的是一类寄生性黏孢子虫。     

不同方法保存的患病异育银鲫中鲤疱疹病毒2型DNA提取和PCR扩增效果分析

以患鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)疾病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)肾脏为实验材料,采用-20℃冷冻、100%乙醇、Dafano's液、10%福尔马林、Zenker's液、Müller's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Mossman's液、Bouin's液和Carnoy's液不同方法进行保存,通过微量分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳探讨不同保存方法对病毒DNA提取效果、常规PCR扩增效果和巢式PCR扩增效果的影响。结果表明:从病鱼肾脏中提取DNA时,除100%乙醇保存方法与-20℃冷冻保存组一样可以提取高质量的DNA外,其它保存方法对DNA提取有不同程度的影响,100%乙醇保存方法和保存的材料可以用作于鲤疱疹病毒2型DNA的提取;常规PCR扩增时,100%乙醇、Zenker's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Bouin's液和Carnoy's液保存方法与-20℃冷冻保存组具有相同的效果,在362 bp处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这6种保存方法及其保存的材料可以用作鲤疱疹病毒2型的常规PCR扩增;巢式PCR扩增时,100%乙醇、Dafano's液、10%福尔马林、Zenker's液、Müller's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Mossman's液、Bouin's液和Carnoy's液所有保存方法与-20℃冷冻保存组具有相同的效果,在339 bp处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这些保存方法及其保存的材料均可以用作于鲤疱疹病毒2型的巢式PCR扩增,在采用巢式PCR进行检测和诊断患鲤疱疹病毒2型疾病上具有应用价值。     

花鲈ncc、nkcc基因在海、淡水适应中鳃组织的表达与定位分析

为探究ncc、nkcc基因在花鲈渗透调节中发挥的作用,实验通过全基因组鉴定、多重序列比对、系统进化树构建以及蛋白结构预测对花鲈ncc进行了鉴定及序列分析,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测ncc和nkcc在海水、淡水花鲈鳃组织中的表达水平,利用原位杂交技术确定ncc2和nkcc1a在海水及淡水花鲈鳃中的表达位置。结果显示,从花鲈中鉴定出2个ncc基因,即ncc1和ncc2,其编码序列(CDS)长度分别为2 691和3 120bp,编码896和1 039个氨基酸,在进化上具有保守性。ncc2在淡水花鲈鳃组织中的表达量显著高于海水,而nkcc1a在海水花鲈鳃组织中的表达量显著高于淡水,ncc1、nkcc1b、nkcc2在海淡水中的表达量则无显著差异。淡水适应过程中花鲈鳃组织中的ncc2的表达量逐渐上调,而nkcc1a的表达量逐渐下调;海水适应过程则呈现相反的表达趋势。此外,原位杂交结果显示,ncc2和nkcc1a基因分别位于淡水与海水中鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮。以上结果表明,ncc2和nkcc1a基因分别编码淡水及海水花鲈鳃中重要的Na⁺及Cl     

淇河鲫cyp19a1b基因的克隆表达及芳香化酶抑制剂对其表达的影响

为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。     

溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护研究

为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护.PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达.ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染.结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物.     

饥饿及恢复喂食对花鲈肠道菌群多样性的影响

为了研究饥饿及恢复摄食对花鲈肠道壁及内容物微生物菌群的影响,实验运用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术分析了花鲈经2周饥饿,恢复喂食1周和恢复喂食2周后肠道壁及其内容物菌群特征及多样性的变化。结果显示:饥饿会导致花鲈肠道壁细菌群落发生明显变化,引起差异的主要细菌为T-RFs 496、437、450、155 bp等所代表菌;经2周饥饿,肠壁T-RF 496 bp大肠杆菌(Escherichia)相对丰度从实验开始的43.11%±3.95%(C0肠壁组)下降为21.25%±9.97%(S2R0肠壁组),细菌多样性指数H′、E′和1/D均增大;恢复喂食2周后,肠道壁菌群结构逐渐恢复,T-RF 496 bp大肠杆菌的相对丰度逐渐上升到55.49%±8.37%(S2R2组),3个多样性指数均减小至原有水平;花鲈肠道壁和内容物的菌群有较大不同,但是两者的主要细菌类群都是变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),其中,γ-变形菌纲是花鲈肠道的最主要细菌群。本研究为进一步阐述消化道微生物功能奠定了基础,也为海水鱼类肠道菌群研究提供基础数据。     

急性氨氮胁迫对黄颡鱼组织抗氧化酶活性及HSP70和HSP90基因mRNA表达水平的影响

为了探讨急性氨氮胁迫对黄颡鱼组织中抗氧化酶活性及HSP70和HSP90基因mRNA表达水平的影响,实验随机挑选了360尾黄颡鱼[初体质量(17.25±0.05)g],分别暴露于含有0(对照)、5.70(低浓度组)、28.50(中浓度组)和57.00(高浓度组)mg/L总氨氮浓度的水体中,进行96 h的急性胁迫实验。实验开始后,分别于0、12、24、48和96 h取样。结果显示,氨氮胁迫发生后,低、中浓度组实验鱼肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升高后降低趋势,而高浓度组则持续降低;低、中、高浓度组实验鱼肝脏中丙二醛(MDA)含量在胁迫开始后显著升高;3 h时,高浓度组实验鱼肝脏中SOD活性达到最低,而MDA含量最高;24 h后,高浓度组实验鱼肝脏中过氧化氢酶(CAT)活性显著升高;低、中、高浓度组实验鱼肝脏中HSP70基因的mRNA表达量呈先降低后升高趋势,而鳃中HSP70基因表达量持续升高,但脑中HSP70基因在0 h后显著降低;氨氮胁迫3 h时,低、中、高浓度组实验鱼肝脏和脑中HSP70基因表达量显著低于对照组,而在鳃中正好相反;相比HSP70基因,高氨氮浓度组实验鱼肝脏和鳃中HSP90基因的mRNA表达量在24 h时达到最高。研究表明,不同浓度的氨氮胁迫会对黄颡鱼抗氧化酶活性造成不同程度的抑制,原因与丙二醛的积累量有关;相比HSP90基因,黄颡鱼HSP70基因的表达量在氨氮胁迫发生后迅速上调,这种生理调控机制提示HSP70在应对急性氨氮胁迫时发挥着更重要的作用。     

引起混养塘中异育银鲫和鲢发病死亡的病原及组织病理

混养的异育银鲫和鲢鱼种大批死亡,为明确发病死亡的病原和组织损伤并提供相关的疾病防控措施,进行了病鱼肉眼和显微镜检查、细菌学检测、病毒学检测、组织病理和药敏试验研究。结果发现,除在患病鱼体表偶然发现有少量不会引起充血等症状的杯体虫和车轮虫外,未在体内外发现其他寄生虫和真菌类病原;通过细菌分离、人工回感试验、生理生化特性和16S r RNA基因序列分析,从患病异育银鲫和鲢分离到的致病菌株均为嗜水气单胞菌;根据异育银鲫和鲢病毒性疾病的现状,使用鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)DNA聚合酶基因的特异性引物分别对自然发病的异育银鲫和鲢进行PCR检测,只有异育银鲫检测到Cy HV-2,分别用它们的除菌组织上清液进行人工感染试验,只有异育银鲫出现充血症状和死亡现象;由此得出嗜水气单胞菌是异育银鲫和鲢发病死亡的主要病原,Cy HV-2是异育银鲫混合感染的次要病原。患病鲢与患病异育银鲫呈现出类似的组织病理现象,又有一些各自特有的组织病理表现,单纯细菌感染的鲢轻度病变以细胞颗粒变性为主,坏死细胞以核溶解为主,细菌和病毒混合感染的异育银鲫肝脏轻度病变以细胞滴状玻璃样变的变性为主,坏死组织细胞以核固缩和核碎裂为主,在肾脏和脾脏出现染色质边集于核膜的肿大细胞核,主要组织器官出现从变性到坏死的病理变化过程,最终失去应有的功能而死亡。依据药敏试验结果,建议内服诺氟沙星和氟苯尼考等抗生素防治本病的嗜水气单胞菌感染,混合感染Cy HV-2的异育银鲫可以通过注射Cy HV-2疫苗和生态养殖的方法控制和减少该病毒病感染和发展。     

香鱼白细胞介素17C基因克隆及鳗利斯顿氏菌侵染后的时空表达

为了解香鱼白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)的序列特征、系统发育及其与鳗利斯顿氏菌侵染的相关性,实验采用RACE-PCR方法扩增出香鱼IL-17C基因c DNA序列,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼各组织中IL-17C基因的表达变化。结果显示,香鱼IL-17C基因c DNA序列全长1 087 bp,含534 bp的开放阅读框,在3′端非编码区存在7个m RNA不稳定信号(ATTTA)。预测该基因编码177个氨基酸,N端19个氨基酸为信号肽序列,成熟蛋白中含有8个半胱氨酸残基。系统进化树分析显示不同物种的相同IL-17亚型聚为一支,香鱼IL-17C与其他脊椎动物IL-17C聚为一支;同源比对结果显示香鱼IL-17C与虹鳟的IL-17C1和IL-17C2亲缘关系最近,相似性分别为40.72%和33.51%。q RT-PCR检测显示IL-17C基因在健康香鱼的心、肝、脾、头肾、鳃、脑、肌肉和肠等组织中均有表达,鳃和头肾中表达量较高。经鳗利斯顿氏菌侵染后,香鱼肝脏中IL-17C基因表达变化最大,菌侵染8 h时的表达量为对照组的9.17倍;其次为脾,菌侵染4 h时的表达量为对照组的6.69倍。研究表明,香鱼IL-17C基因的表达与病原菌侵染密切相关,可能在免疫功能中具有重要作用。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

大黄鱼性别特异SNP标记的开发与验证

大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类,其雌鱼生长显著快于雄鱼,但两性的外部形态差异不明显,也没有异形性染色体,依靠传统方法无法对其活体准确进行生理性别和遗传性别的判别与鉴定,需要开发性别特异的分子标记。本研究从2尾雌鱼和2尾雄鱼、以及分别由50雌鱼与50尾雄鱼组成的2个混合样品的基因组重测序数据比较中筛选与性别显著关联的SNP位点,对其中11个位点分别设计引物在15尾雌鱼和15尾雄鱼中扩增出PCR产物进行Sanger测序验证,鉴定出1个与性别完全连锁的位点(SNP6,15尾雌鱼均为纯合、15尾雄鱼均为杂合)。然后,设计等位基因特异性PCR引物,其中包括2条雌性与雄性通用引物和1条雄性特异引物,在闽—粤东族与岱衢族大黄鱼合计近2 200个个体中进行扩增,结果在全部雌鱼中都只扩增出1个348 bp的条带,而在全部雄鱼中还扩增出1个194 bp的Y染色体特异条带,检出率达到100%。研究表明,大黄鱼属于XX♀-XY♂类型的性别决定。本研究鉴定出一个雄性特异SNP标记,并建立了一种新的大黄鱼遗传性别鉴定技术,为大黄鱼单性育种、基因组选择育种和性别决定分子机制研究提供了重要的技术手段。