PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法的建立及应用

在异育银鲫（）引起的“喉孢子虫病”常会导致池塘养殖苗种和成鱼大量死亡。因此，建立一种特异性强、灵敏度高和易于操作的检测方法对于该病的早期诊断以及防治具有重要意义。本研究基于洪湖碘泡虫18S rDNA基因序列设计合成两组特异性引物，通过外引物组和单条内引物组合及条件优化，建立了洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度及临床应用分别进行了验证。结果显示，该检测方法特异性好，只有洪湖碘泡虫扩增为阳性，瓶囊碘泡虫（Thelohanellus wuhanensis）及异育银鲫肌肉样品等均为阴性；最低检测灵敏度极限为4.2 copy/μL；对疫区养殖池塘健康异育银鲫的卵巢、肾脏及脾脏组织样品检测发现洪湖碘泡虫阳性率分别为40%、32%和8%，检出率显著高于普通PCR。因此，本研究所建立的检测方法特异性强、灵敏度高，可应用于洪湖碘泡虫的早期快速检测。     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

近年来，虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大，已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针，通过优化反应条件，建立检测EHP的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法。建立的方法呈良好的线性关系(R²=0.998)，灵敏度是巢式PCR的10倍。特异性试验表明：检测其他常见病原均为阴性，特异性好；重复性试验显示：批内批间变异系数均小于1.5%，重复性良好；对临床样品检测，与巢式PCR的符合率为97.81%。使用该方法对中山市、江门市和珠海市珠三角部分地区南美白对虾开展EHP流行病学调查，其中虾苗检出率为10.75%，成虾检出率为54.07%，部分区域检出率较高，要防范爆发风险。本研究建立的实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性和重复性良好，具有较好的应用前景。     

禽流感病毒H7N9亚型三重荧光PCR检测方法研究

目的建立一套能够同时检测禽流感病毒H7N9经典毒株和新型变异毒株的多重荧光定量PCR方法。方法以禽流感病毒H7N9亚型HA保守基因、HA裂解位点和NA基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,建立三重荧光PCR检测方法,并对该方法进行特异性和敏感性验证。结果参考GenBank收录毒株序列设计引物;探针分别选用ROX、FAM、VIC为荧光基团;阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点;试剂盒特异性好不受其他亚型流感病毒以及常见禽类病毒的干扰;灵敏度可以达到100~101个EID50。结论该研究建立的荧光PCR检测方法敏感特异,能够用于禽流感病毒H7N9毒株检测。     

养殖沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用GyrB基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌菌液加入灭菌的沉积物样品中,作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板,建立沉积环境中气单胞菌属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法,同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明,采用改进的溶菌酶-SDS温和裂解法提取沉积物DNA,以扩增GyrB基因片段的IAF和IAR为特异性引物,并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线,可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘底泥中气单胞菌属中不同种的细菌,检出效率可达103CFU/g。统计分析显示,变异系数为0.21%-0.80%,均小于5%,表明重复性良好。     

基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估

为建立岩原鲤基于环境DNA （eDNA）的实时荧光定量PCR （qPCR）检测方法,准确鉴别岩原鲤并探讨e DNA浓度与其生物量的定量关系,实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针,利用PCR扩增出岩原鲤12S rRNA基因的序列,克隆入pMD19-T载体,构建重组质粒作为qPCR标准;使用梯度稀释质粒标准品作为模板,进行qPCR扩增,制作标准曲线,建立岩原鲤qPCR检测方法,并评价其特异性、灵敏性和应用效果。结果显示,引物和TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,显示阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号,表现为阴性;qPCR的阈值循环数（C_t）与标准品拷贝数的线性关系好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数（R²）达到0.999,检测限位DNA浓度为5×10^-6 ng/μL,扩增效率为94.7%;检测养殖不同数量岩原鲤的水体中eDNA浓度,目标DNA浓度和岩原鲤数量存在线性正相关性（R²=0.957）,得到岩原鲤DNA浓度与其个体数...     

[鱼师]诺卡菌特异性PCR快速检测方法的建立

[鱼师]诺卡菌（Nocardia seriolae）是危害中国南方大口黑鲈（Micropterus salmoides）养殖业的主要病原之一，由于该菌在培养基上生长缓慢，对其分离鉴定造成诸多不便。文章根据[鱼师]诺卡菌16S-23S转录间隔区（ITS）序列设计特异性引物建立了[鱼师]诺卡菌特异性PCR快速检测方法。试验结果表明，利用设计的特异性PCR引物只能扩增出[鱼师]诺卡菌特异性片段，检出限为5pg模板DNA。在此基础上研制了PCR快速检测试剂盒并对[鱼师]诺卡菌人工感染的大口黑鲈组织进行了检测，结果显示该试剂盒能从未出现明显发病症状的大口黑鲈组织中检出阳性片段，阳性率为100％，比传统细菌分离鉴定方法更加灵敏、快速且高效，具有较好的应用前景。     

基于鞭毛蛋白基因的坚强芽孢杆菌特异性套式PCR和荧光定量PCR方法的建立

细菌鞭毛蛋白编码基因hag具两端的保守序列及中间可变区域,在细菌的分类和鉴定中可作为分子标记。本研究克隆了坚强芽孢杆菌鞭毛蛋白编码基因hag部分序列,根据所得核酸序列设计套式引物Bfho和Bfhi,进行菌株的套式PCR特异性检测。此外,采用内引物Bfhi建立坚强芽孢杆菌荧光定量PCR特异性检测方法并确定该方法的检测限,对15个模拟样品进行检测并对阳性组中坚强芽孢杆菌的含量进行定量分析。结果显示,克隆得到的坚强芽孢杆菌hag基因长为1213 bp,经比对,与枯草芽孢杆菌hag基因相似性为13%-15%。荧光定量PCR方法对坚强芽孢杆菌菌株PC004和PC024的检测限分别为17.3×103和19.7×103 CFU/ml。模拟样品检测结果显示,15个样品中检测出7个阳性,并同时定量各样品中坚强芽孢杆菌的含量。本研究建立的坚强芽孢杆菌检测方法特异性强、操作时间短、灵敏度高,可为该菌的实际检测提供技术支持。     

基于toxR基因的轮虫弧菌荧光定量微流控快速检测技术的建立

以轮虫弧菌的单拷贝基因toxR基因的高保守区域为目的片段，设计特异性引物，构建重组质粒标准品，建立针对该菌的荧光定量PCR检测方法。以此为基础，实验选用UF-150 Genechecker微流控荧光定量PCR仪，通过优化反应体系和反应条件，建立了轮虫弧菌的微流控荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法能特异性扩增toxR基因目的片段，对轮虫弧菌纯培养物检测下限为1.34×10⁰ 拷贝/μL。在人工感染样品中的应用结果显示，对鱼体组织中轮虫弧菌的检测下限为1.34×10³ CFU/g，检测结果可以目视判读，检测时间缩短至42 min以内。研究表明，该检测方法具有特异性强、敏感度高、场地要求低等突出优势，适于开发水产病原实用性的现场快速检测技术。     

青岛近海赤潮灾害分级与时空分布及赤潮生物的变化

根据赤潮发生面积和赤潮藻类的危害类型,将青岛近海发生的赤潮划分为特大、重度、中度、轻度和轻微共计5个灾害级别。结果表明,1990-2013年青岛近海共计发生赤潮33次,以轻微灾害和轻度灾害为主,其它级别尚未发生;其中,发生面积小于10 km2赤潮占总数的51.5%,60.6%的赤潮由基本无害的赤潮种类引起,发生范围以胶州湾和浮山湾近海为主;赤潮次数和面积基本呈现4~5年的波动周期,高发期集中在每年的6-8月;主要赤潮生物种类是红色中缢虫(Mesodinium rubrum)和夜光虫(Noctiluca scintillans);引发赤潮的生物种类逐渐增多,甲藻比例升高,罕见种类逐渐出现。赤潮种类的变化反映出青岛近海浮游植物的种类组成发生了改变,与期间青岛近岸海洋环境的变化密切相关。     

2000－2013年中国南部近海赤潮发生规律及影响因素研究

利用历年中国海洋环境质量公报、灾害公报、南海海洋环境质量公报以及相关统计数据,以2000-2013年广东省、广西壮族自治区和海南省发生的赤潮事件为对象,研究了中国南部近海赤潮发生的时空动态、赤潮生物的生态演替以及与温度、营养盐、地理水文要素和厄尔尼诺-南方涛动事件(ENSO)的关联。结果表明:(1)时间分布上,赤潮高发期为2月和8月,9月和12月发生频次较低;(2)空间分布上,赤潮集中发生在珠江口以及大鹏湾、大亚湾、深圳湾3个海湾,汕头港、汕尾港、湛江港以及涠洲岛、硇洲岛附近也是赤潮频发海域;(3)引发赤潮的生物共检出31种,包括甲藻20种、硅藻5种、金藻2种、蓝藻2种、黄藻1种、原生动物1种,共检出149次,其中以金藻门的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)、甲藻门的锥状施克里普藻(Scrippsiella trochoidea)、夜光藻(Noctiluca scintillans)、红色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)以及硅藻门的中肋骨条藻(Skeletonema costatum)出现次数较多;(4)赤潮生物存在着明显的季节演替现象,温度和营养盐结构对赤潮爆发及其优势种演替起关键作用,高通量的陆源污染物与弱化的水动力相互叠加为诱发赤潮提供了条件,而厄尔尼诺效应强度与赤潮发生面积呈显著正相关(P<0.05)。     

赤潮与海洋劳动者收入关系探析

赤潮是影响海洋劳动者收入最经常、最直接的因素，赤潮直接或间接地影响海洋劳动者的就业和收入水平，涉及的数额很大，范围很广，主要表现在海洋赤潮通过赤潮水体和赤潮生物毒素经由海洋各产业影响海洋劳动者收入。文章基于海产品市场、海产品经营者市场和海产品消费者市场，将赤潮与海洋劳动者收入的关系通过经济学分析细节化、系统化和全面化地展现出来，为研究作好整体的铺垫。     

赤潮对日本养殖业的危害及其防治对策

报导了日本濑户内海１９７２年至１９８４年和西海岸１９８５年至１９９２年赤潮对海水养殖业所造成的经济损失情况，给出了发布赤潮注意报和赤潮警报期间应该采取的防治措施。     

三种赤潮微藻基因组DNA快速制备方法的研究

采用超声波法、煮沸法和微波法3种方法分别对塔玛亚历山大藻、环状异帽藻和角毛藻进行细胞破碎及快速制备基因组DNA的研究。通过细胞计数和DNA浓度测定的手段对三种方法进行了比较,以选择适合不同藻种的细胞破碎方法。结果表明,塔玛亚历山大藻和环状异帽藻用超声波法破碎效果较好;角毛藻用微波法较好。对用该三种方法制备的基因组DNA做了PCR扩增,电泳检测表明,与CTAB法扩增效果一样。本文建立的微藻DNA快速制备方法有望应用在赤潮藻类的快速分子鉴定方面。     

同安湾赤潮监测站位优化设置

根据同安湾赤潮监测资料,对监测站位进行二次背包模型优化。将现有4个监测点优化为3个最佳监测点,研究表明,优化后的站位所表征的赤潮监测信息量,与原监测信息量等效,可作为今后的常规监测站位。二次背包模型对海洋环境监测站位优化布设非常适用,模型具有简易性和实效性。本文应用MATLAB和LINGO数学软件,详细介绍二次背包模型的求解过程。程序简单、方便使用。     

海州湾海域的赤潮生物

利用2003—2008年海州湾海域浮游植物的调查资料,对海州湾海域常见的赤潮生物进行描述、归纳及总结,为赤潮的常规监测和应急监测提供背景资料。结果表明,在海州湾海域共监测到121种赤潮生物,其中重要的赤潮生物有:中肋骨条藻、夜光藻、多纹膝沟藻、短角弯角藻、赤潮异弯藻、链状裸甲藻、海链藻属,这7种(属)赤潮生物都曾经在该海域引发过赤潮。此外,中华盒形藻、海洋原甲藻、梭角藻、三角角藻、圆筛藻属、角毛藻属等赤潮生物在海州湾海域常年分布,也具有引发赤潮的可能。     

基于BP神经网络模型的福建海域赤潮预报方法研究

赤潮往往给渔业生产和人类的生命安全造成极大的危害,但由于赤潮的成因十分复杂,对其进行预报非常困难。本研究收集了福建海区2000年至2016年发生的219个赤潮案例有效数据,应用BP神经网络人工智能模型建立了其与气温、降水、风速、气压和日照5个气象因子的非线性关系,并将这些赤潮案例数据与相应的气象指标按闽东、闽中和闽南3个海区,分别输入模型进行学习、训练与预测。结果显示:1)闽东海区53个训练样本45个预测正确,正确率达84.91%,3个模拟预测样本全部正确;2)闽中海区69个训练样本58个预测正确,正确率达84.06%,4个模拟预测样本全部正确;3)闽南海区85个训练样本的运算预测结果63个正确,正确率74.12%,5个模拟预测样本全部正确,达到预期的结果。研究表明,以气象因子为自变量采用BP神经网络模型对赤潮的发生进行预测是可行的,该方法可为赤潮的预测提供新的途径。     

诱发三都湾海域赤潮的原因探讨

2012年4月23日三都湾海域爆发赤潮,爆发时间长达16d,主要是由血红哈卡藻(Akashiwo san-guinea)为优势藻种引起的。本文通过对三都湾海域大黄鱼种质资源养殖基地的海水进行分析,来探讨此次赤潮的原因。结果发现,在发生赤潮前期水温急剧上升,从11.80℃升至21.20℃,赤潮发生时的水温维持在16.40～21.20℃之间;盐度呈现下降状态,从25.12‰降至23.30‰;pH呈现明显上升状态,从8.03升至8.25;营养状态指数E值维持在1.6～9.2之间,长期属于富营养化状态。本研究结果表明,本次赤潮发生与水温、盐度、pH以及水体富营养化等密切相关。     

东海1972年一次毛丝藻赤潮的分析

1972年8月至11月于东海北部(30°N—32°N,127°E以西)部分海域中所出现的赤潮是由蓝藻门中的三种毛丝藻组成,即(1)汉氏毛丝藻 Trichodesmium Hildebrandtii Gomont(2)薛氏毛丝藻 Trichodesmium Thiebautii Gomont(3)红毛丝藻 Trichodesmium erythraeum Ehr.。其中汉氏毛丝藻为优势种。这次赤潮主要形成于长江口以东外海,9月份后虽扩大分布区,但仍以东部海区最密集。11月后逐渐消失。此次赤潮最明显的危害表现在对饵料基础的破坏上,它能引起鲐、鲹鱼索饵渔场位置的改变和洄游路线的变化,从而促成减产。经分析,此次形成赤潮的原因主要是由于由该年夏季气旋而引起的涌升流和连续的强台风等因素的综合作用结果。以使上、下层搅拌剧烈,营养盐充分溶于水中增加了肥沃度。加上秋季水温偏高和高温水体的出现,也为热带性藻类繁殖提供了有利条件。本文作者建议,今后随着现代工业的发展,应加强对海洋污染和赤潮预报的研究。