秋、冬季节刺参养殖池塘浮游细菌数量变化规律的研究

应用平板稀释涂布培养计数法和荧光显微镜计数法,对秋、冬季(2008年9月～2009年2月)刺参养殖池塘水体中的浮游细菌数量变化规律进行了分析。结果表明,吖啶橙染色直接计数法(AODC)测得细菌总数的变化范围是1.0×106～2.1×107个/ml,活菌直接计数法(DVC)测得活菌总数的变化范围是4.0×105～5.7×106个/ml。异养细菌平板计数法(HPC)测得异养细菌数量为0.6×102～1.7×105CFU/ml。TCBS平板培养的弧菌数量在6.6×103CFU/ml以下。从时间分布看,刺参养殖池塘水体中浮游细菌数量最高值出现在10月份,最低值出现在1月份,秋季细菌数量显著高于冬季(P0.01)。从空间分布看,水体底层细菌数量显著高于表层(P0.05)。利用SPSS13.0软件对所得到的数据进行统计分析表明,同一样品不同计数方法获得的细菌总数数值之间存在显著的相关性(P0.01)。     

军曹鱼肠道及水体异养菌和弧菌的周年变化

采用总活异养菌2216E平板计数法和弧菌TCBS平板计数法对广东深圳大鹏养殖军曹鱼(Rachycentron canadum Linnaeus)养殖水体及鱼肠道细菌进行了周年监测。结果显示,育苗初期养殖水体异养菌和弧菌密度分别为0.63×104～6.2×104CFU/mL和0.30×102～1.03×104CFU/mL,鱼肠道异养菌和弧菌密度分别为0.80×106～7.5×107CFU/g和0～1.30×107CFU/g;网箱养殖监测期间,养殖水体异养菌和弧菌密度分别为4.20×103～5.40×105CFU/mL和0.70×102～1.14×105CFU/mL,鱼肠道异养菌和弧菌密度分别为1.50×107～8.78×108CFU/g和1.00×107～3.50×108CFU/g。周年监测结果显示,水体异养菌、弧菌的数量高峰均出现于8-9月份;肠道异养菌及弧菌的数量高峰均出现于6-7月份,分别又在12月份和2月份出现次高峰,弧菌变化趋势始终与异养菌一致。对分离得到的407株菌鉴定到属并进行多样性分析。结果显示,育苗期水体以假单胞菌(Pseudomonas)、黄单胞菌(Xanthomonas)和芽孢杆菌(Bacillus)为优势菌,三者约占水体异养菌总数的70%;养殖后期,弧菌(Vibrio)和发光杆菌(Photobacterium)的数量逐渐上升并占据一定优势,其中假单胞菌、黄单胞菌、弧菌和芽孢杆菌常年出现。鱼肠道异养菌以假单胞菌和芽孢杆菌为优势菌,其次是肠杆菌科(Enterbacteriaceae)细菌,也多次检测到弧菌、发光杆菌、气单胞菌(Aeromonas)和小球菌(Microccus)等。总之,养殖微生态系统的可持续稳定平衡与系统的种群多样性、群落组成及水质因子等因素相关,而整个环境生态系统的平衡直接影响到鱼类肠道的细菌生态系统。     

刺参养殖池环境细菌群落对底质改良剂的响应

运用平板培养计数法、最大或然数法和16S rRNA 基因的 PCR-DGGE 指纹图谱技术,分析发病刺参池塘环境中不同生理类群细菌数量及群落结构对底质改良剂的响应。结果显示,加入底质改良剂后,发病刺参池塘沉积环境中的总异养菌、硝化细菌、硫酸盐还原细菌等的数量在最初的2–4 d 有所上升,但升高幅度小于对照组,且在之后的2–4 d 内下降至加改良剂之前菌量;在加入底质改良剂后第2天,弧菌和硫化细菌数量便迅速下降,明显低于对照组。PCR-DGGE 图谱及测序结果显示,刺参养殖环境细菌优势菌分别属于绿弯菌门、变形菌门的莫拉菌科、柄杆菌科和气单胞菌科以及厚壁菌门的芽孢杆菌科和乳杆菌科的某种细菌,多样性指数在2.5–3.5之间。实验组加入底质改良剂后,气单胞菌属两种细菌数量逐渐下降。研究结果表明,底质改良剂可改变沉积环境中不同细菌类群的数量,降低致病菌的数量,从而改善底质环境并对“刺参腐皮综合征”起到防治作用。     

养参池底泥弧菌数量变动及微生态制剂对其影响

2010年和2011年连续对放养相同密度刺参池塘底泥中弧菌总数的变化进行了监测,探讨微生态制剂对刺参养殖池塘底泥弧菌数量的影响.结果显示,新池塘弧菌总数在同一时期显著低于老池塘,投施微生态制剂试验组池塘底泥中弧菌总数显著低于对照组.活菌浓度为1.25×106 cfu/L时,微生态制剂效应周期为12d.微生态制剂具有很强的抑制弧菌的作用.     

乳酸菌对牙鲆稚鱼养殖水体和肠道菌群的影响

在牙鲆稚鱼中投喂添加由单一鼠李糖乳杆菌P15制备的微生态制剂和黄霉素,在60d的投喂期内,采用平板计数法检测好氧性异养菌的总数、总弧菌数和乳酸菌的数量。结果表明,在投喂菌液和冻干菌粉后,养殖水体和牙鲆肠道的乳酸菌数均呈上升趋势,在30d后乳酸菌数量达到稳定并在肠道内定植。同时,由于乳酸菌的抑制作用,弧菌的数量下降,以肠道中的弧菌最明显。乳酸菌对养殖水体和牙鲆肠道的好氧性异养菌没任何影响。乳酸菌对养殖水体和肠道菌群的影响与抗生素具有相近的效果,表明乳酸菌作为饲料添加剂可以取代抗生素应用在牙鲆的养殖中。     

池塘养殖刺参腐皮综合征发病环境因素分析

通过对2014年7—8月山东省青岛市红岛邵哥庄(SGZ)和宿流(SL)两个社区的发生刺参腐皮综合征和未发病刺参养殖池的环境因子跟踪监测和对比,解析发病的原因。从发病前至发病后,分别监测了两地多个池塘水体中的4类可培养细菌(总异养菌、弧菌、硝化细菌和硫化细菌)和6项理化参数(温度、p H、盐度、溶解氧、无机氮、COD),以及沉积环境中6类可培养细菌(总异养菌、弧菌、硝化细菌、硝酸盐还原菌、硫化细菌、硫酸盐还原菌)和4项理化参数(pH、氧化还原电位、硫化物、有机碳)。结果表明,刺参发病时,邵哥庄发病池(SGZ-1~#)环境中细菌数量与未发病对照池(SGZ-2~#)无显著差异,但温度高达25.94℃,盐度低至24.47,均超过刺参耐受限度。水体NO_2-N含量为79.56μg/L,沉积物中硫化物含量为221.1 mg/g,均高于对照池;宿流发病池SL-南2弧菌数量(1.85×10~4 CFU/mL)在发病当日明显升高,高于对照池SL-北1和邵哥庄社区的发病池,而发病池的理化指标反而好于对照池。由此推断,邵哥庄社区的刺参发病与池塘理化指标突变有密切关系,而宿流的刺参发病与病原菌数量激增有密切关系。因此,应从理化指标和病害生物两方面对刺参病害进行预警及采取防治措施。     

梭子蟹养殖环境及生物体内细菌的数量动态及区系组成

研究结果表明:随着养殖的结束,池塘水体和底泥中总异养菌数和反硝化细菌、氨化细菌、硫酸还原菌等特殊生理类群的数量均显著降低。从梭子蟹养殖环境及生物体内分离到115株细菌,经鉴定可归于9个属与肠杆菌科的部分属。通过监控养殖环境中异养细菌和弧菌的数量波动,可以预警梭子蟹病害的发生,及时采取有效的应急防治措施。     

虾池沉积物中3类主要细菌的垂直分布特征

采用平板涂布法和MPN法测定了虾池底质下 0到 30cm深度范围内 3类主要细菌类群的垂直分布情况。结果表明 ,底泥中细菌主要集中于 0到 5cm的表层范围内 ,随深度增加 ,数量急剧减少 ,至 30cm深处所测到菌量已很少。底泥中的总菌量随养殖时间推移 ,逐渐增加 ,到养殖中后期 ,表层菌量增加至 10 6CFU/g ,表层以下 10～2 0cm的总异养菌量和硝酸盐还原菌数量也增加至 10 5CFU/ g以上。弧菌仍集中于表层。细菌的垂直分布主要受各层有机物和溶解氧含量的影响     

芽孢杆菌对泥蚶和养殖底质中菌群的影响

在泥蚶养殖水体中（1000L）投喂浓度分别为1、5和10g微生态制剂（芽孢杆菌），在30天的投喂期内，采用平板计数法检测底泥中、泥蚶体内的细菌总数和弧菌总数。结果表明，在投喂冻干菌粉后，养殖底泥和泥蚶体内菌群在前7天均呈明显上升趋势，7-30天内缓慢下降。由于芽孢杆菌的抑制作用，弧菌的数量下降，以泥蚶体内的弧菌最明显。芽孢杆菌对养殖底泥和泥蚶体内的细菌菌群影响很大，芽孢杆菌对养殖水体底泥和体内菌群的影响与抗生素具有相近的效果，表明芽孢杆菌作为饲料添加剂可以取代抗生素应用于泥蚶养殖。     

固定化微藻对养殖对虾细菌数量的影响

以固定化技术为基础,人工制成微藻藻珠,引入波吉卵囊藻(Oocystisborgeisnow)和微绿球藻(Nannochloropsis oculata)于凡纳对虾(Litopenaeusvannamei)养殖环境中,采用直接计数法研究了养殖水体、对虾肌肉、对虾肝胰脏中异养菌及弧菌的数量变化。结果表明,引入藻珠能抑制异养菌和弧菌的生长,并能改善水质。试验末期,试验1、2、3组水样中弧菌数量分别降低了95%、95%、81.7%,异养菌数量降低了72.3%、77.1%、95.6%。可见固定化微藻在一定程度上能改善虾池细菌生态系,有助于预防对虾疾病。     

流沙湾海区异养菌和弧菌动态变化规律研究

对流沙湾海区异养菌、弧菌动态变化规律及其优势菌群进行了初步探讨。采用平板稀释法对异养菌和弧菌数量进行了周年检测;对优势菌株进行分离纯化,并对代表性月份样品优势菌中的弧菌进行菌种鉴定。结果显示,流沙湾海区的异养菌和弧菌密度分别为8.8×103~9.60×105cfu/mL和1.0×103~2.45×104cfu/mL,其中异养菌数量高峰出现在6月,弧菌数量高峰出现在12月,异养菌、弧菌数量与水温变化的相关性不明显;流沙湾海区优势菌群中存在着溶藻弧菌等多种致病性弧菌。     

头孢氨苄对斑节对虾幼体发育及育苗水体细菌数量的影响

研究了不同浓度头孢氨苄(Cefalexin)对斑节对虾Penaeusmonodon幼体发育以及对斑节对虾育苗水体中异养菌总数和弧菌数量的影响。在试验初期,无论是对照组还是施用头孢氨苄的各试验组,育苗水体中的总异养菌数量和弧菌数量都呈现出较为明显的上升趋势;在第二次施用头孢氨苄后,各试验组的异养菌总数和弧菌数量的增幅明显低于对照组(或出现异养菌总数和弧菌数量缓慢下降),而对照组异养菌总数和弧菌数量则呈现显著的上升。施用0.5～1.0μL·L-1头孢氨苄对育苗水体中的总异养菌有显著的杀灭及抑制作用,但对弧菌数量杀灭及抑制作用并不显著;施用1.5μL·L-1头孢氨苄对育苗水体中的总异养菌和弧菌数量的杀灭及抑制作用显著。当幼体变态发育至仔虾第8天(P8)时,对照组异养菌总数和弧菌数量分别达6.33×105和3.55×104CFU·mL-1,均远远高于试验组的异养菌总数和弧菌数量增长的幅度。试验组的幼体变态到P1期的时间,比对照组缩短了10h以上;试验组的成苗率也比对照组提高了3.2%～13.1%。     

池塘养殖刺参病原菌塔式弧菌的分离与鉴定

2013年春季,福建漳州地区池塘养殖刺参(Apostichopus japonicus)感染不明病原而患病。病参表现出排脏、身体萎缩、体表溃烂等症状,俗称为"腐皮综合征"。为确定引起该病的病原菌,从患病刺参病灶部位分离得到1株优势菌FJY001,经回接感染试验,证实所分离的细菌为刺参的病原菌。经形态、生理生化、16S rRNA序列分析和Biolog微生物自动鉴定系统等多项指标鉴定,确定该病原菌为塔式弧菌(Vibrio tubiashii)。     

斑节对虾双季养成期间虾池水质和底泥细菌含量的变化

本文报导了斑节对虾双季人工淡化养殖,虾池水与底泥异养菌和弧菌的数量变化及其与主要理化环境因子的关系。表明上半年的第一茬养殖虾池无论是水或底泥的异养菌数和弧菌总数均容易调控在低数量水平,第二茬养殖由于高水温持续整个养殖周期,诸多环境因子波动较大,在人工管理调节下,虾池主要环境因子(细菌数、化学耗氧量、氨氮、溶解氧、pH值)仍处在正常的范围内,但是却显示不出它们之间的相关性,在两茬的养殖中底泥异养菌数和弧菌数都分别比水中高两个数量级和一个数量级。     

刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病，导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板，PCR扩增出16s-23s间隔区序列，将该片段克隆进pMD19-T Vector，转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物，合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性，而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性；探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测，其检出率均为100%。研究结果表明，该探针具有良好的特异性和敏感性，可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次，它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

夏季保苗期刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征病原菌的分离鉴定及其致病阈值

2013年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发 腐皮综合征疾病,表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌,并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、16S rDNA基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外,通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化,追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示,从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌HP130917A-1,经回接感染证实,该菌株具有较强的致病力,其对刺参苗种的半致死浓度为1.2×106 CFU/ml。生理生化结合分子鉴定表明,该菌株为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。此外,完成了患病池保苗期间池水和附着基表面微生物菌群结构动态分析,共分离得到了6种主要优势菌,分别为溶藻弧菌、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。溶藻弧菌一直是养殖系统中优势度最高的种类,且随着附着基在保苗池中时间的延长,其在附着基表面沉积物中的浓度越来越高。到第50天时,浓度达到8.97×106 CFU/cm2。而此时系统中参苗开始暴发腐皮综合征疾病,可将此浓度视为该病原的致病阈值。因此,在夏季保苗过程中应加强养殖系统中弧菌总数的监测,制定适宜的附着基更换频率,建立和优化刺参保苗工艺,以期为刺参苗期疾病防控和优化健康养殖管理提供理论依据和参考。     

夏季保苗期刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征病原菌的分离鉴定及其致病阈值

2013年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发腐皮综合征疾病,表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌,并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、16S rDNA基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外,通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化,追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示,从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌HP130917A-1,经回接感染证实,该菌株具有较强的致病力,其对刺参苗种的半致死浓度为1.2×106 CFU/ml。生理生化结合分子鉴定表明,该菌株为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。此外,完成了患病池保苗期间池水和附着基表面微生物菌群结构动态分析,共分离得到了6种主要优势菌,分别为溶藻弧菌、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。溶藻弧菌一直是养殖系统中优势度最高的种类,且随着附着基在保苗池中时间的延长,其在附着基表面沉积物中的浓度越来越高。到第50天时,浓度达到8.97×106 CFU/cm2。而此时系统中参苗开始暴发腐皮综合征疾病,可将此浓度视为该病原的致病阈值。因此,在夏季保苗过程中应加强养殖系统中弧菌总数的监测,制定适宜的附着基更换频率,建立和优化刺参保苗工艺,以期为刺参苗期疾病防控和优化健康养殖管理提供理论依据和参考。     

养殖刺参腐皮综合征 2 种致病菌间接荧光抗体快速检测方法

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征的2种致病菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清。以载玻片为介质,建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。交叉反应、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验中的养殖水体及发病刺参溃烂组织检测,可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌,病原菌被染成明亮的黄绿色,检测灵敏度2.4×104cell/mL。冰冻切片检测结果显示,在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明:采用IFAT可以对刺参腐皮综合征2种致病菌进行准确快速的检测。该方法的建立对刺参腐皮综合征的流行病学调查及快速诊断具有重要意义。     

刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌检测探针的制备及应用

腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病.发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重.以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序.根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针.该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V. Fluvialis,V. Anguillarum,V. Alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V. Harveyi,V. Parahaemolyticus,V. Vulnificus均呈阴性.探针对灿烂弧菌DNA的检出限为6.25 pg, 具有较高敏感度.用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交,灿烂弧菌检出率达100%.结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可用于快速检测养殖刺参腐皮综合征的病原灿烂弧菌.用该方法检测刺参腐皮综合征尚属首次,为刺参腐皮综合征的快速诊断和防治提供技术支撑.     

老化参池刺参腐皮综合征致病原的分离与鉴定

从患病刺参体表病灶组织分离出菌株060330B,其优势度高达90%,人工回接感染试验证实其具有较强的致病性,可导致健康刺参出现与自然患病刺参相同的症状。通过形态学观察、API半自动化鉴定和常规生理生化试验的结果表明,菌株060330B具有假单胞菌属的特征,其表型特征与恶臭假单胞菌相似。对该菌株进行16SrRNA基因序列分析和构建系统发育树,结果显示其与恶臭假单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到99.5%。菌株060330B可鉴定为恶臭假单胞菌,并视为养殖刺参腐皮综合征的致病原之一。通过对多起不同来源患病刺参的研究表明,使用年限长、淤泥层厚呈黑色并伴有腥味的养殖池塘在该时期容易导致刺参腐皮综合征的发生。