淇河鲫与不同品系锦鲤杂交F1代的遗传多样性研究

为预测适合的杂种优势组合,给淇河鲫杂种优势的利用和长远规划的制定提供理论和实践依据,以淇河鲫作母本,红色、白色、黄色和黑色4个品系的锦鲤作父本,杂交产生F1代,采用COⅠ基因标记分析了杂交子一代的遗传距离,研究它与杂种优势表现之间的关系。运用PCR技术扩增了父母本及F1子代的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因片段;用ClustalX软件对序列结果进行统计和分析,采用邻接法构建分子系统树。结果表明,10种鱼COⅠ片段的平均GC含量为44.5%,AT含量为55.5%。依据Kimura-2-parameter模型,亲本间遗传距离最大的是淇河鲫与红色锦鲤(0.1374),其次是淇河鲫与黄色锦鲤(0.1367),淇河鲫与白色和黑色锦鲤的遗传距离相当;淇河鲫和红色锦鲤的杂交子代与淇河鲫的遗传距离最小,与淇河鲫遗传距离最大的是淇河鲫和白色锦鲤的杂交子代。     

养殖褐牙鲆细胞色素b基因序列的初步研究

对养殖褐牙鲆(Paralichthys olivacews)的线粒体DNACytb基因的部分序列进行测定，测得的目的DNA片段的长度为410bp，其A(104bp)、T(119bp)、C(117bp)、G(70bp)4种碱基平均含量分别为25．4％、29．0％、28．5％、17．1％。在28个褐牙鲆个体中共出现了3种单倍型。白化褐牙鲆出现的第1种和第3种单倍型个体数分别为10尾(占白化褐牙鲆样本数的如90．91％)和1尾(9．09％)；6尾黑化褐牙鲆均出现第1种单倍型(100％)；正常褐牙鲆出现的3种单倍型尾数分别为7尾(占正常褐牙鲆样本数的55．56％)、2尾(22．22％)和2尾(22．22％)；测得的序列与既知序列间在第6bp、第19bp和第402bp碱基处出现差异。由于褐牙鲆Cytb基因的高度同源性，研究其白化、黑化和正常状态时出现的序列差异，对于寻找褐牙鲆白化机理研究的分子标记意义重大。     

中国、日本和澳大利亚珍珠贝的ITS 2序列特征分析

对中国、日本和澳大利亚的珍珠贝核糖体DNA第二内部转录间隔子(ITS2)的序列特征进行了分析。PCR扩增产物包括5.8S基因部分序列、ITS2基因和28S基因部分序列。去除引物序列后5.8S基因片段长64bp,ITS2长230～237bp,28S基因片段长249bp。共分析了16个基因型的序列特征,结果表明,5.8S和28S基因片段高度保守,仅28S有1个碱基位点突变;而ITS2变异大,237个比对位点中有20个位点发生突变,其中12个位点为缺失/插入突变,4个简约信息位点。在碱基组成中,5.8S和28S的GC含量(58.1%～59.4%)高于AT含量,也高于ITS2的GC含量(51.3%～52.0%),ITS2的GC含量与AT含量相差不大。碱基组成中5.8S的A碱基含量较低,28S的T碱基含量较低,存在较大的碱基偏倚性。3个地理群体内和群体间的遗传距离都很小(0.010～0.013),且相互重叠。从基因型数据看,3个群体既有各自独立的基因型,也有共享基因型。但从序列的碱基变异数据看,3个群体没有各自独有的突变位点。上述结果表明,3个地理群体既具有丰富的遗传多样性,又具有高度的遗传一致性,即亲缘关系近,可能存在基因交流,或者分化时间不长。丰富的遗传多样性有利于合浦珠母贝的遗传选育。     

淇河鲫与不同品系锦鲤杂交F1代遗传多样性研究

以淇河鲫为母本,红色、白色、黄色和黑色4品系锦鲤为父本,杂交生产F1代,淇河鲫自交作为对照。运用PCR技术扩增了父母本及F1子代的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因片段。用ClustalX软件对序列结果进行统计和分析,采用邻接法构建分子系统树。结果表明,10种鱼COⅠ片段的平均GC含量为44.5%,AT含量为55.5%。依据Kimura-2-parameter模型,亲本间遗传距离最大的是淇河鲫与红色锦鲤(0.1374),其次是淇河鲫与黄色锦鲤(0.1367),与白色和黑色锦鲤的遗传距离相当;杂交子代中,以淇河鲫与红色锦鲤杂交所得子代与淇河鲫的遗传距离最小,最大的是白色锦鲤和淇河鲫杂交子代。     

淇河鲫与不同品系锦鲤杂交F1代遗传多样性研究

以淇河鲫为母本,红色、白色、黄色和黑色4品系锦鲤为父本,杂交生产F1代,淇河鲫自交作为对照。运用PCR技术扩增了父母本及F1子代的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因片段。用ClustalX软件对序列结果进行统计和分析,采用邻接法构建分子系统树。结果表明,10种鱼COⅠ片段的平均GC含量为44.5%,AT含量为55.5%。依据Kimura-2-parameter模型,亲本间遗传距离最大的是淇河鲫与红色锦鲤(0.1374),其次是淇河鲫与黄色锦鲤(0.1367),与白色和黑色锦鲤的遗传距离相当;杂交子代中,以淇河鲫与红色锦鲤杂交所得子代与淇河鲫的遗传距离最小,最大的是白色锦鲤和淇河鲫杂交子代。     

凡纳滨对虾亲本和子一代群体的线粒体DNA遗传特征研究

对凡纳滨对虾亲本和子一代进行线粒体控制区扩增,经测序共获得53个样本(亲虾15个,子一代38个)的线粒体D-loop区序列,长为530 bp,序列有24个变异位点,总变异为4.53%,1个插入和(或)缺失位点,共13种单倍型,13个单倍型T、C、A、G的平均含量分别为48.8%、10.6%、33.6%和7.0%,(A+T)%为82.4%,远大于(G+C)%的17.6%。亲本群体与子一代群体碱基含量相同,没有差异。凡纳滨对虾亲本15个个体有5个单倍型,单倍型多样性为0.695,核苷酸多样性为0.010 26,子一代单倍型多样性为0.772,核苷酸多样性为0.01038。凡纳滨对虾亲本群体与子一代群体的遗传距离为0.001,其中亲本群体内个体间的平均遗传距离为0.0145,子一代群体内平均遗传距离为0.0120。亲本和子一代间的遗传分化系数为-0.036 44,AMOVA分析显示,变异主要来自于群体内,亲本与子一代间无分化。     

杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子一代的RAPD分析

杂色鲍野生群体和养殖群体分别自交和杂交产生野生鲍自繁F1代(WW)、养殖鲍自繁子代(CC)、正交子一代(W♀×C♂,简称WC)和反交子一代(C♀×W♂,简称CW)4个群体,采用RAPD分析4个群体遗传特性。就多态位点比例、Nei基因多样性值和Shannon信息指数而言,WW群体比CC群体高;杂交群体WC的值分别为88.76%、0.3246和0.4811,比其余群体都要高,与群体WW最接近;另一杂交子代群体CW除多态位点比例比群体CC高外,其余参数均为最低。群体间的遗传距离分析表明,WW与各群体的遗传距离都较大,其中与CC群体的遗传距离最大,为0.0849,与两个杂交群体间的遗传距离分别为0.0772(CW)和0.0671(WC);CC群体与两个杂交群体间的遗传距离都较小,分别为0.0610(与CW)和0.0597(与WC);杂交子代间的遗传距离为0.0600;杂交群体WC与WW的遗传距离大于与CC的遗传距离,CW与WW的遗传距离也大于与CC间的遗传距离,两个杂交群体与亲本的遗传距离不对等,偏向养殖亲本。     

11种鲈形目鱼类的核糖体基因GC含量及其与硬骨鱼类的特征比较

核糖体基因为串联重复多拷贝的基因,包括3个编码基因(18S,5.8S,28S)和两个间隔区ITS1(internal transcribed spacer 1)和ITS2(internal transcribed spacer 2)。目前,对核糖体基因的相关报道主要集中在个体内不同拷贝间的多态特征,以及其作为分子标记在系统演化关系中的应用,GC含量作为一项非常重要的核苷酸序列指标,而鲜有报道。为了探讨鱼类的核糖体基因GC含量特征以及间隔区是否也存在GC平衡现象,本研究选择了鲈形目(Perciformes)5科11种鱼类5个片段的核糖体基因进行研究,包括尖吻鲈科(Latidae)、射水鱼科(Toxotidae)、军曹鱼科(Rachycentridae)、剑鱼科(Xiphiidae)、鲹科(Carangidae)。获得了1651个单克隆序列,通过分析并比较已有的其他硬骨鱼序列片段的GC含量变化特征,结果发现:本研究鱼类的18S的GC含量为52.6%~57.1%(平均54.6%),5.8S为55.6%~58.9%(平均57.4%),28S为64.2%~65.8%(平均64.6%),ITS1为56.5%~73.0%(平均65.0%),ITS2为62.3%~77.5%(平均69.1%)。编码区的GC含量相对较保守,变异范围较小,18S和5.8S变化范围明显小于间隔区,28S则位于间隔区的最低值和最高值之间。因此,我们发现硬骨鱼核糖体ITS高于60%的GC含量是该类群的一个特征,并且高GC含量的ITS1和ITS2序列中不存在明显的高GC富集区,其含量高低的变化与序列长度也没有相关性。本研究11种鱼类的ITS1和ITS2的GC含量在种内的相似性既有大于也有小于种间相同片段的相似性,因此GC平衡现象只存在部分种类中。本研究结果可为鱼类核糖体基因序列特征的进一步研究及利用提供科学依据。     

8种鲆鲽鱼种间遗传距离与杂交亲和性的相关性分析

2005-2008年,先后进行了褐牙鲆♀×夏牙鲆♂、褐牙鲆♀×石鲽♂、褐牙鲆♀×条斑星鲽♂、褐牙鲆♀×大菱鲆♂、大菱鲆♀×条斑星鲽♂的正反交试验,并收集了文献报道的研究资料,包括条斑星鲽×圆斑星鲽、石鲽×星斑川鲽、夏牙鲆×漠斑牙鲆及褐牙鲆×圆斑星鲽的正反交试验结果,对所涉及的8种鲆鲽鱼远缘杂交亲和性进行分析。根据Russell对杂交亲和性的定义,正反交均可行,杂交适合度为1;正反交单向可行,杂交适合度为0.5,正反交均不可行,杂交适合度为0。同时,根据这8种鲆鲽鱼的16S rDNA和COⅠ基因部分序列的差异,估算其种间遗传距离。对8种鲆鲽鱼的种间遗传距离和杂交适合度作相关性分析,二者呈线性负相关(R2=0.81,P<0.01),即杂交的亲和性随种间遗传距离增大而降低。研究表明,鲆鲽鱼的杂交亲和性与其遗传分化程度具有相关性,可以通过种间遗传距离对鲆鲽鱼远缘杂交的亲和性进行预测。     

基于微卫星亲权鉴定技术的短蛸性选择研究

为研究短蛸(Octopus ocellatus)的性选择行为，本研究利用14个多态性微卫星标记，对3个母本、176个子代及17个候选父本进行亲权鉴定，对3个家系中有子代和无子代雄蛸、子代比例高和子代比例低的雄蛸的各形态参数进行t检验，并对子代比例高和子代比例低的父本与母本的遗传相似性与遗传距离进行分析。结果显示，短蛸为多雌多雄的交配模式，为真正意义的雌性混交动物；雄蛸有无子代与其形态参数无相关性；子代比例与父本的形态大小参数无关，而与父母本的遗传相似性和遗传距离有关，父母本遗传相似性越高，遗传距离越小，后代比例越高。本研究为揭示短蛸交配前后的性选择机制提供了重要线索，也为海洋头足类动物的性选择机制研究提供了基础资料。     

脊尾白虾3个野生群体ITS1序列分析及其亲缘关系分析

对脊尾白虾的莱州湾、海洲湾、象山湾3个野生群体共计62个个体的核糖体RNA转录单元内间隔区ITS1基因片段进行克隆和测序,对序列特点进行分析,并结合GenBank数据库中已有的长臂虾亚科ITS1同源序列虾类进行系统分析。结果显示,脊尾白虾的ITS1序列具有长度多态性,其长度为345~384 bp,62条序列GC的平均含量显著高于AT含量;共检测到79个变异位点,39种单倍型,多态位点比例为21.7%;海洲湾群体遗传多样性指数最高,象山湾群体次之,莱州湾群体最低。在脊尾白虾ITS1序列中发现微卫星序列共有8处,重复序列类型为(GC)n、(AG)n、(GGC)n、(GGA)n、(AT)n、(GA)n,以(GA)n类型最多。AMOVA分析结果显示3个群体间的遗传分化较弱或只有中度分化。另外用MEGA4.0软件中的NJ法构建分子进化树,探讨长臂虾亚科几个种的系统进化关系,系统树显示同种的不同个体、同属的不同种聚在一起,与形态学的分类吻合。     

日本对虾养殖群体两个世代遗传结构的微卫星分析

利用8对微卫星引物对日本对虾养殖群体两个世代的遗传结构进行了分析,共检测到108个等位基因,等位基因长度为196-528 bp,各位点等位基因数为6-23个。亲本和子代群体每个位点平均等位基因数目分别为8.5个和11.5个,平均观测杂合度分别为0.721和0.632,平均期望杂合度分别为0.775和0.764,平均多态信息含量分别为0.732和0.729。根据标记信息,利用最大似然法对两个世代的个体分别进行系谱结构推断,亲本群体划分为6个群体,群体间遗传距离为0.277-2.356,均值为1.510;子代群体划分为17个群体,群体间遗传距离为0-2.593,均值为1.113。亲本和子代分群体间的遗传距离变化范围为0-3.089,均值为1.238。根据各分群体间的Nei's遗传距离,用非加权组平均法(UPGMA)构建了日本对虾两个世代的遗传进化树。其中18个分群体(4个亲本群体和14个子群体)经过聚类后形成3个分支,其余5个分群体(两个亲本群体和3个子群体)明显偏离于主支。研究发现,子代的观测杂合度明显低于亲本,说明子代在继承亲本遗传信息的过程中已经丢失了一定的杂合性。     

利用微卫星标记高效鉴定松浦镜鲤的亲缘关系

用37尾雌和14尾雄松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu构建37个血统明确的全同胞家系,同池、同条件养殖。用筛选出的9个多态性微卫星标记和建立的多重PCR检测方法进行子代群体(1 318尾)的亲权鉴定。9个位点共检测到53个等位基因,各位点均为高度多态(PIC0.5),平均期望杂合度为0.742,观测杂合度为0.755。亲本基因型信息的模拟分析显示,利用9个标记将子代分配到亲本对的成功率可达100%。实际鉴定结果:1 287尾个体准确鉴定到配组的亲本对,鉴定成功率为97.6%。以上结果表明:本研究提供的标记和检测方法可用于松浦镜鲤的亲本遗传距离分析和家系亲缘追溯,也适用于群体遗传多样性监测。     

中华鲟MHC IIB基因遗传多样性初步研究

为了给中华鲟(Acipenser sinensis)全人工种群优化和繁殖管理提供理论依据,探究中华鲟主要组织相容性复合体(MHC)IIB基因的部分遗传信息和遗传变异规律,利用特异性引物MHC IIf和MHC IIr,分别从30尾野生中华鲟个体、29尾中华鲟子一代个体和30尾中华鲟子二代个体的基因组DNA中扩增MHC IIB基因的多肽结合位点(PBR)片段,扩增产物长度为168 bp。结果表明,中华鲟野生群体30个样品的95个有效克隆中共检测出30条特异序列(单倍型),中华鲟子一代群体29个样品的96个有效克隆中共检测出38条特异序列(单倍型),中华鲟子二代群体30个样品的95个克隆中检测出36条特异序列(单倍型)。单倍型的分布及群体内遗传多样性参数分析表明,中华鲟子一代群体的MHC IIB基因遗传多样性最高,子二代中华鲟群体的MHC IIB基因遗传多样性最低。中华鲟3个群体的非同义替代(dN)与同义替代(dS)比率为1.39、1.48和1.45,非同义替换率均大于同义替换率,表明正向选择可能是中华鲟MHC IIB多态性的主要因素。     

褐牙鲆中miRNAs与甲状腺激素受体TRβ的相互作用研究

甲状腺激素通过与其受体结合对褐牙鲆变态起重要的调控作用,而miRNAs通过结合靶基因3′-UTR在转录后水平调节靶基因的表达。为探讨miRNAs在褐牙鲆变态中的作用,通过生物信息学方法预测褐牙鲆TRβ基因3′-UTR存在的miRNAs结合位点,并利用3′-RACE方法克隆TRβ基因的3′-UTR序列,通过体外DNA重组技术构建应用于miRNAs靶向基因检测的双荧光素酶重组报告载体,利用细胞转染和双荧光素酶报告技术分析多个miRNAs与TRβ基因的作用关系。研究结果显示,克隆得到了一段长为437 bp的褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR序列,发现3′-UTR序列上存在pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p、pol-miR-138和pol-miR-125a*的结合位点,成功构建了双荧光素酶重组报告载体,命名为pmirGLO-TRβ-3′-UTR。双荧光素酶报告分析结果表明,pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p和pol-miR-138均为作用于褐牙鲆TRβ的靶向miRNAs,而pol-miR-125a*对TRβ基因无直接的调节作用。研究结果将为后续深入研究miRNAs与TRβ在褐牙鲆变态发育中的功能及其作用机制提供基础。     

珠母贝属6个种的ITS 2分子标记研究

对珠母贝属的大珠母贝、珠母贝、白珠母贝、黑珠母贝、长耳珠母贝、黑珠母贝和合浦珠母贝6个种的内部转录间隔区2(ITS2)序列及其两侧的5.8S和28S的部分序列进行了比较分析。其中黑珠母贝的序列来自GenBank。PCR扩增片段大小为600bp左右,测序结果表明,ITS2长211～254bp,两端的5.8S和28S分别长84bp和272bp(均含引物)。序列比对分析结果表明,5.8S和28S序列高度保守,不适合于种类鉴定,而ITS2序列高度变异,270个比对位点中有146个位点发生突变,其中72个位点发生插入/缺失突变。除白珠母贝和黑珠母贝之间的遗传距离较小外,其余种类之间的遗传距离远远大于种内遗传距离。基因型分析表明,每个种具有各自特有的基因型。基因型和序列变异分析表明ITS2序列可作为珍珠贝种类鉴定的分子标记。可用于种间、杂交育种、幼体和珍珠贝肉等材料的种类鉴定与遗传分析。     

全雌褐牙鲆稚鱼对硫酸铜和甲醛的耐受性实验

以全雌褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)稚鱼为研究对象,通过96h急性毒性试验,研究了硫酸铜和甲醛对全雌褐牙鲆稚鱼的半数致死浓度(LC50)和安全浓度(SC)。全雌褐牙鲆稚鱼对硫酸铜48h、96h的LC50分别为4.68mg·L-1、2.097mg·L-1,SC为0.209 7mg·L-1;对甲醛48h、96h的LC50分别为95.941mg·L-1、48.61mg·L-1,SC为4.861mg·L-1。     

牙鲆SRF基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-SRF构建成功,为进一步研究SRF在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。     

mtDNA 和微卫星标记在放流牙鲆和非放流牙鲆鉴定中的应用

用mtDNA控制区特异性引物对牙鲆(Paralichthys olivaceus)亲鱼、放流牙鲆和回捕牙鲆的DNA进行扩增,获得了3个群体的mtDNA控制区第一高变区部分序列。分析结果表明:母本55尾具有26种单倍型,作为其子代的预备放流牙鲆129尾具有5种单倍型,与亲本的单倍型全部一致,验证了mtDNA方法鉴定子代的准确性。回捕牙鲆435尾具有70种单倍型,其中330尾具有17种单倍型,与母本的单倍型相一致,为疑似放流牙鲆;另外105尾具有53种单倍型,与母本的单倍型不一致,为野生牙鲆或非北戴河站母本后代放流牙鲆。利用4个高多态性微卫星标记对330尾疑似放流牙鲆做进一步鉴定。结果表明,330尾检测个体中有310尾等位基因与候选亲本等位基因全部对应,可确认其为放流牙鲆;另外20尾等位基因与候选亲本不对应,可确认其为非放流牙鲆。结合mtDNA和微卫星标记鉴定的结果,可以确认2013年的435尾回捕牙鲆中有310尾放流牙鲆,占71.26%;另外125尾为非放流牙鲆,占28.74%。本研究结果表明,利用mt DNA标记可快速排除回捕鱼中的非放流牙鲆,利用微卫星标记作进一步鉴定,可以排除疑似放流牙鲆中的非放流牙鲆,是区分放流牙鲆与非放流牙鲆,准确评价放流效果的好方法。     

中国海区不同养殖品系海带与长海带之间的遗传关系

对中国海区海带(Laminaria japonica)不同栽培品系(种)及长海带(L.longissirna)的配子体无性繁殖系进行12个酶系统的同工酶检测,获得了31个基因位点,酶谱分析结果说明,来自同一株海带的雌、雄配子体无性繁殖系具有较高的遗传相似性,但“860”品系可能因杂合度大,导致该品系雌、雄配子体无性繁殖之间的遗传距离较远。对它们相应的亲本孢子体进行RAPD分析,30个随机引物共得到185个扩增位点,其中多态性位点76个,占41％。利用UPGMA对同工酶及RAPD所得到的遗传距离进行聚类分析,表明中国海区养殖海带的不同品系或品种之间的遗传相似性较大,而“烟杂1号”与长海带之间具有较近的亲缘关系。基于同工酶和RAPD图谱的结果推测,“烟杂1号”是一个新的杂交种,其母本可能是“荣杂1号”,而父本可能是长海带。