锈凹螺褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵沉淀、离心超滤、DEAE-Sephadex A25、Sephadex G-100和Sephacryl S-300 HR 柱层析等方法从海洋食藻性锈凹螺(Chlorostoma rustica)消化腺中分离纯化出一种褐藻胶裂解酶(Alginate lyase),得到电泳纯酶制品,并对此酶的酶学性质进行了研究.结果表明:此褐藻胶裂解酶的分子量为28 kD,反应的最适温度为40 ℃,具有热不稳定性,最适pH为7.0;酶的反应受多种离子的影响,Mn2 、Co2 和Cd2 对此褐藻胶裂解酶活性具有明显的抑制作用,而Mg2 、Zn2 、Na 和K 则具有促进作用;采用透明圈法和底物法验证了此裂解酶对聚甘露糖醛酸和聚古洛糖醛酸的特异性,实验表明,此酶对聚古罗糖醛酸(Polyguluronate,PG)有特异性.     

南极磷虾粗酶液中蛋白酶的基础酶学性质研究及抑制剂的开发

本研究探讨了反应温度、pH、金属离子(Zn~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)和Ca~(2+))对南极磷虾粗酶液中蛋白酶活性的影响,研究了苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA·2Na、碘乙酰胺(IAM)和甲苯磺酰–苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对蛋白酶活性的抑制效果。结果显示,南极磷虾粗酶液中蛋白酶的最适反应温度为40℃;最适反应pH值为8.0;当金属离子浓度为0.5 mmol/L时,Zn~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)金属离子对蛋白酶酶活的抑制率分别为55.02%、55.02%、35.39%、20.67%和41.12%,而Ca~(2+)离子对蛋白酶活有明显的促进作用;PMSF和EDTA·2Na对蛋白酶酶活具有较为显著的抑制作用,PMSF的浓度为8.0 mmol/L时,抑制率为60%;EDTA·2Na浓度为0.6 mmol/L时,抑制率为86.67%;IAM在低浓度时有一定的抑制作用;TPCK低浓度时抑制效果不明显,浓度升高时有一定的抑制作用。在5~30℃的温度范围内,随着温度升高,EDTA·2Na对蛋白酶酶活的抑制效果逐渐增加。本研究阐明了影响南极磷虾粗酶液蛋白酶酶活的因素,开发了针对南极磷虾粗酶液中蛋白酶活性的抑制剂,为南极磷虾在食品领域的开发利用提供了基础理论数据。     

罗非鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的纯化、性质及农药敏感性研究

以罗非鱼脑组织为材料,研究了乙酰胆碱酯酶的分离纯化方法、性质及杀虫剂对酶的抑制作用。结果表明,当脑组织的TritonX-100抽提物采用(NH4)2SO4分级盐析、Sephadex G-100凝胶过滤和DEAE-纤维素DE23离子交换柱层析的分离纯化步骤后,可获得纯化的乙酰胆碱酯酶,酶的比活力达到20.628U.mg-1, 纯化倍数139,回收率22.1%。酶作用最适温度为35～40℃,最适pH为7.5～8.0,对碘化硫代乙酰胆碱的Km值为0.183mmol.L-1,有过量底物抑制现象,最佳底物浓度为6mmol.L-1。被测4种农药中,有机磷类杀虫剂对罗非鱼脑AChE的抑制能力高于氨基甲酸酯类,抑制能力分别为：敌敌畏 > 辛硫磷 > 三唑磷 > 灭多威, 4种杀虫剂对罗非鱼脑AChE的I50值均小于5μg.mL-1。     

产海洋细菌MP-2酯酶菌株的鉴定及酯酶理化性质的研究

从渤海海泥样品中分离获得1株新型酯酶菌株,经鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。所得的MP-2酯酶的最适作用温度范围50～70℃,在60℃表现出了最高活性,属于耐热酶;最适作用pH为10,属于碱性酶,其pH值作用范围比较窄;具有良好的热稳定性;金属离子Co2＋,Li＋对酶具有激活作用,Ca2＋对酯酶的活力没有显著影响,化学试剂SDS、EDTA及Tween-20对酯酶的抑制效果显著,对常见有机溶剂具有良好的耐受力;该酯酶对碳链长短不同的底物表现出不同的酶活。     

草鱼酸性磷酸酯酶的性质及金属离子对其活性的影响

以草鱼肝脏为材料提取一种酸性磷酸酯酶(ACPase,EC.3.1.3.2),进一步用(NH4)2SO4沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定呈现单一酶蛋白带,该酶紫外吸收峰为240nm和280nm,等电点为4.8,相对分子质量为100046.1。该酶水解对硝基苯磷酸二钠(pNPP)的最适pH值为4.4,最适温度为45℃,并有热激活现象,热激活温度为60℃。耐热实验表明,该酶在最适温度下耐热时间为33min,最适温度下20min时表现出最大活性。在60℃下耐热时间为25min,15min时表现最大活性。酶促反应初速度为0.0475μmol/min,最大反应速度为0.153μmol/min。米氏常数Km值为3.56×10-3mol/L。金属离子对酶活性影响的研究结果表明,K+对酶有激活作用,Li+、Na+对酶的活性没有明显影响;碱土金属离子Mg2+、Ca2+和Ba2+对酶有激活作用,其激活程度由大到小依次为:Ba2+、Mg2+、Ca2+;Mn2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+、Co2+则有抑制作用;重金属离子Hg2+、Pb2+、Ag+和Cd2+对酶有抑制作用,其中Hg2+的抑制效应最强。Mg2+和Cu2+的作用机制研究结果表明,Mg2+对酶具有混合型激活作用,Cu2+对酶具有竞争性抑制作用。     

驼海燕内脏中蛋白酶的提取及其酶学性质的研究

以驼海燕为原料,用丙酮沉淀法制备蛋白酶粗酶,并对其酶学性质进行研究。试验结果表明,提取蛋白粗酶的最佳条件为:原酶液与丙酮的体积比为1∶1.6;蛋白酶反应的最适温度为45℃,最适pH值为8.1;pH为7～9时可保持较高的酶活力;蛋白酶的酶活力在20～50℃基本稳定。酶促反应结果表明,Na+、K+、Li+、Mg2+对蛋白酶活力具有促进作用,而Zn2+、Cu2+、Hg2+能抑制蛋白酶的活力,EDTA对蛋白酶活力的影响甚微。酶动力学方程表明,最大反应速度vmax=5.99U/mL,米氏常数Km=0.69g/mL。     

美国红鱼血清溶菌酶性质及其应用

用硫酸铵沉淀法对美国红鱼(Sciaenops ocellatus)血清溶茵酶进行初提,采用分光光度法研究pH和温度对该溶茵酶活力的影响,同时研究溶茵酶在高温条件下的稳定性及金属离子对其活性的影响.并试验该溶茵酶对奥尼罗非鱼生长和存活的影响.结果表明,美国红鱼血清溶茵酶的最适pH为6.84,最适温度为31℃;该酶在60℃以下活性稳定;Cd2 、Pb2 、Ag 、Mn2 等对美国红鱼血清溶茵酶具有非常明显的抑制作用,而Ca2 和Na 对美国红鱼血清溶茵酶具有激活作用.结果有助于该酶活力测定条件的进一步完善.以有效地测定鱼体非特异性免疫水平.同时发现用该溶茵酶处理奥尼罗非鱼,可提高其成活率.     

几种金属离子对鲢肝胰脏淀粉酶的影响

以鲢的肝胰脏为材料,取组织匀浆上清液作为酶液进行研究.结果表明:鲢肝胰脏淀粉酶的最适pH为6.8,最适温度为35℃,最适底物浓度为0.03%.进一步研究1、2价金属离子和重金属离子对鲢肝胰脏淀粉酶活力的影响,结果表明:1价金属离子K+、Na+对酶活力没有影响,2价金属离子Ba2+、Ca2+对酶活力具有抑制作用,重金属离子Cd2+、Hg2+对酶活力具有显著的抑制作用.     

琼胶降解菌AT-22的筛选和产酶性质

从青岛近海的红藻(Gelidium amansii)中分离筛选到1株高活力的海洋琼胶降解菌AT-22，对其生长、产酶特性和酶活力影响因素进行初步研究。结果表明，AT-22所产琼胶酶为诱导酶，0．2％葡萄糖的添加对菌株产酶有抑制作用。该酶作用的最适pH值为6．0-7．0，最适温度为40℃，最适底物质量分数为1％～1．2％，Ca^2 的添加对酶促反应有较强的促进作用，而Fe^3 、Mn^2 、Cu^2 和Hg^2 等有不同程度的抑制作用。     

温度、pH对克氏原螯虾血清酚氧化酶活力及稳定性的影响

以克氏原螯虾(Procam barus clarkii)为材料,研究温度、pH对其血清酚氧化酶活力及稳定性的影响。实验以L-dopa为反应底物,在试验设计的温度范围(20,30,40,50,60,70℃)内,测得酚氧化酶活力的最适温度为20℃,随温度升高酶活力迅速下降,该酶在20~40℃范围内表现出较高的热稳定性,而30℃时最稳定;该酶的最适pH 7.0,在pH 6.0和7.0的缓冲系统中表现出较强的稳定性。     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响

通过围隔实验比较罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响。实验设置6种养殖模式:罗氏沼虾单养(MP)、罗氏沼虾+浮萍(水面覆盖率5%)(PP)、罗氏沼虾+鲢(PF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+鲢(PMF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍(PMP)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍+鲢(PMPF)。养殖64 d后,测定不同模式中浮游植物和三大类浮游动物(轮虫、枝角类及桡足类)的种类和数量。结果显示,上述6种模式中浮游植物共同优势种有4种,但优势度指数最大的浮游植物不同,MP组是锥囊藻属,有浮萍的PP和PMP组均为细小平裂藻,混养鲢的PF、PMF和PMPF组均为针杆藻。不同养殖模式无共同的浮游动物优势种。养殖模式对浮游生物密度具有显著影响,PF组浮游植物密度最高,MP组浮游植物密度最低,PF组浮游植物密度比MP、PP和PMP组分别高78%、53%和61%。相反,浮游动物密度MP组最高,PF组最低。混养鲢的PF、PMF和PMPF组浮游动物密度显著低于其他3组。研究表明,罗氏沼虾养殖中混养鲢可增加浮游植物密度而降低浮游动物密度,浮萍和鲢影响池塘优势种。     

大菱鲆高温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特性分析

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。     

二氧化锗对共培养萱藻丝状体和硅藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体保存和扩增过程中出现的小伪菱形藻与碎片菱形藻的生长,本实验应用实验生态学方法,分别建立了丝状体与小伪菱形藻、丝状体与碎片菱形藻、丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系,研究了1.00～4.00μg/mL二氧化锗(GeO_2)对共培养条件下丝状体生长发育及附生硅藻生长的影响。结果显示:(1)处理萱藻丝状体和硅藻共培养体系的适宜GeO_2浓度为1.00～2.50μg/mL,各实验组14 d的硅藻抑制率均高于67.33%±5.18%,且丝状体生长发育良好,2.00μg/mL为最适浓度,此浓度下丝状体日均增长率最高,在各培养体系中均大于11.00%,且诱导后孢子囊枝比例和孢子囊直径分别为57.47%±5.31%和(24.55±1.01)μm,与对照组差异不显著;(2) 3.50和4.00μg/mL GeO_2虽对硅藻抑制效果更佳,但同时也会抑制丝状体生长和后期孢子囊的形成与发育,其中4.00μg/mL GeO_2可导致丝状体死亡;(3)碎片菱形藻较小伪菱形藻对GeO_2更敏感。实验14 d,各浓度GeO_2对碎片菱形藻的抑制率为(82.10%±2.40%)～(96.35%±0.79%),均高于同浓度GeO_2对小伪菱形藻的抑制率;同时在丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系中,碎片菱形藻占硅藻比例随GeO_2浓度升高而相应下降。     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

Use of Microbacterium sp. and Exiguobacterium mexicanum to improve the survival and development of Artemia under xenic conditions

The effect of Microbacterium sp. strain 8L and Exiguobacterium mexicanum strain 8N was evaluated in the diet of Artemia under xenic conditions. Viable cultures of bacteria were provided to xenic cultures of Artemia in combination with Sacharomyces cerevisiae, cornflour or Spirulina, and the effect on the survival and growth was recorded. The use of these bacterial strains improves significantly the survival of Artemia independently of the used food (P < 0.05), and variable results were observed in the growth.     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

Movement of the fluvial form of masu salmon, <Emphasis Type="Italic">Oncorhynchus masou masou</Emphasis>, in a mountain stream in Kyushu,Japan

Using mark-recapture methods, the movements of the fluvial form of masu salmon (Oncorhynchus masou masou) in a mountain stream on the island of Kyushu, Japan, were studied. Most (78%) of the masu salmon were recaptured in the pool in which they had been originally caught and tagged. Of those that moved between pools, the proportion of individuals that moved during the breeding period was not significantly higher than the proportion that moved during the non-breeding period. However, during the breeding period, a higher proportion of larger salmon moved than did smaller fish. The proportion of mobile large males during breeding period was higher than that for small males. Also, it was found that a few individuals showed long-range movement in the autumn. As a long-term movement, 78 individual fish (65%) that were recaptured more than three times showed high sedentary tendencies. Sixteen individual mobile fish (13%) moved and returned to the original pool. Fluvial form of masu salmon in Kyushu show a high sedentary nature; however, large mature males seem to actively move in search of female during breeding period.