对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白VP110部分重组表达及其与对虾鳃细胞膜蛋白结合分析

将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。     

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白抗血清的制备及应用

应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH 5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白.经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57 kDa.Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别.用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA显示抗体效价可达1∶64 000.经制备的抗血清可以作为一抗建立ELISA检测方法,用于检测细胞悬液的病毒粒子,将抗血清稀释到1∶16 000仍能与IHNV全病毒发生反应.本研究利用重组的IHNV糖蛋白成功制备了高效价的抗血清,并能够与IHNV全病毒发生特异性结合,为IHNV免疫学检测方法建立奠定了基础.     

青鱼Dazl基因的原核表达及其多克隆抗体制备

实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体。然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。     

鲤春病毒血症病毒G蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR方法扩增鲤春病毒血症病毒糖蛋白G的部分基因序列,即全基因组序列上第3 094~4 170位的碱基,并将其克隆至表达载体pGEX-KG中,构建重组质粒SVCV-g-KG。将重组质粒转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,表达了与预期大小相符的约66 kDa的融合蛋白,可溶性分析表明该蛋白主要表达在包涵体中。将纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。酶联免疫吸附试验检测其抗体效价可达1∶256 000,间接免疫荧光试验和免疫印迹试验证明其与病毒结合活性良好,特异性高;病毒孵育试验结果表明该多克隆抗体具备中和活性,能够有效阻断鲤春病毒血症病毒对细胞的感染。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) CD59基因的原核表达与功能探究

本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式.结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高.对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59.该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好.Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达.对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功.选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白pET-32a-CD59的抑菌活性.研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性.本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础.     

黄鳝醛酮还原酶基因的重组表达及多抗制备

为实现原核表达黄鳝醛酮还原酶基因并制备其多克隆抗体,笔者利用基因特异性引物自黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝醛酮还原酶全长序列,将之克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组表达载体;经测序验证后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和柱纯化了重组蛋白,通过多次免疫新西兰兔制备了多克隆抗体;采用Western blot和免疫组化法鉴定兔抗醛酮还原酶多克隆抗体的特异性,用间接ELISA技术检测多抗的效价。结果发现成功构建pET/Eakr原核表达载体,并实现了重组蛋白的融合表达和纯化;Western blot检测表明制备的兔多克隆抗体不仅能特异性地识别来源于黄鳝4种组织的醛酮还原酶蛋白而且还可识别来源于黄颡鱼、团头鲂、乌鳢、鲫鱼和草鱼的同源蛋白。免疫组化结果提示该多抗可特异性识别黄鳝小肠、肝胰组织和脾脏的醛酮还原酶蛋白。制备的多抗效价达1∶6400。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)CD59基因的原核表达与功能探究

本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式。结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高。对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59。该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好。Western blotting分析结果显示,重组蛋白p ET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达。对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功。选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白p ET-32a-CD59的抑菌活性。研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性。本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础。     

绵羊FHL2蛋白原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

通过表达和纯化重组的绵羊FHL2抗原蛋白和制备其多克隆抗体,用于研究该蛋白的生物学功能及绵羊繁殖调控的作用机制。研究采用PCR技术扩增绵羊FHL2蛋白的编码序列,利用限制性内切酶双酶切后插入pET28a-sumo中,加入0.5 M IPTG诱导蛋白表达,利用Ni-NTA纯化获得48 ku的重组FHL2蛋白。以重组FHL2蛋白为抗原,混合佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠,获得抗FHL2的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示抗体效价达到1:6 400。通过转染pEGFP-C1-FHL2质粒至HEK 293F细胞,提取细胞总蛋白,利用制备的抗FHL2多克隆抗体检测蛋白的结合力,具有良好的免疫原性,为研究FHL2蛋白的生物学功能及繁殖调控机制提供良好的基础材料。     

紫贻贝LC3B蛋白的原核表达及抗血清制备

LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10 h后,可以得到高表达量、可溶性的重组MgLC3B-His融合蛋白,亲和层析纯化后,获得单一条带的MgLC3B-His可溶性重组蛋白;采用纯化后的MgLC3B-His融合蛋白对新西兰兔进行多次免疫,采集分离兔抗血清并利用protein A纯化,获得紫贻贝的LC3B多克隆抗体,效价为25 600。紫贻贝LC3B多克隆抗体的成功制备,为今后深入开展紫贻贝及相近物种的细胞自噬研究奠定了基础。     

仿刺参补体AjC3部分基因的原核表达及多克隆抗体的制备

通过制备仿刺参补体C3(AjC3)多克隆抗体,为进一步研究仿刺参补体AjC3免疫机制奠定基础。利用PCR技术扩增AjC3部分基因片段(4556~5110bp),将该片段与原核表达载体pGS-21a连接。将重组表达质粒转化到Transetta(DE3)中经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍柱纯化后,作为抗原免疫小鼠制备AjC3多克隆抗体。分别用间接ELISA,Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,PCR扩增得到约555bp的目的片段,重组蛋白分子量大小约56ku;间接ELISA检测抗体效价达1∶25600,Western blot结果显示,多克隆抗体具有良好的特异性。该试验成功的制备了补体AjC3多克隆抗体,为补体AjC3的进一步研究提供了检测工具。     

用IGF—ⅠmRNA表达量评价鲮饲料配方效果的研究

试验以秘鲁鱼粉为饲料蛋白源，研究4种蛋白水平（21．5％、32．2％、42．5％和51．6％）的饲料对鲮（Cirrhinus molitorella）生长、消化酶活性及类胰岛素生长因子（IGF—Ⅰ）mRNA表达水平的影响。经过8周的养殖试验，不同饲料蛋白水平下，蛋白酶活性与特定生长率（SGR）成极显著的正相关性（P〈0．01）；鲮肝组织中IGF—ⅠmRNA的表达量与特定生长率成极显著正相关性（P〈0．01）；鲮肝组织IGF—ⅠmRNA的表达量与蛋白酶活性也成极显著正相关性（P〈0．01）。结果表明，用鲮肝组织IGF—ⅠmRNA的表达量可以快速鉴定饲料的质量。     

鲤胰岛素样生长因子Ⅱ的克隆表达与抗体制备

从鲤(Cyprinus carpio)肝脏总RNA中成功地克隆和诱导表达了胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因,并用间接ELISA法和Western-blot对其融合蛋白的多克隆抗体的效价和特异性进行了分析。结果表明,克隆的鲤IGF-Ⅱ基因与已报道的序列相比,有1个位点发生同义突变;经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总量的35%。经ELISA测定,制备的抗体效价为6400。Western blot分析表明,抗血清能与重组蛋白发生特异性反应     

杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种胞外产物毒性及免疫原性分析

用玻璃纸平板法提取了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Aeromonassal monicida masoucida的胞外产物（ECP）。毒性试验证实，ECP对剑尾鱼Xiphophorus helleri具有致死性，其半致死量（LD50）为4.72μg蛋白/g体重。SDS-PAGE表明，ECP由13条蛋白带组成。利用大鼠抗ECP血清进行的Western-blot印迹显示，组成ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性，能够引发机体的免疫应答反应产生抗体，其分子量分别为88、70、42、39、36、22和15kDa。     

锯缘青蟹血清凝集素的特性和盐析提取研究

对锯缘青蟹(Scylla serrate)血清凝集素的凝集特性进行了研究。结果显示:锯缘青蟹血清凝集素对人、兔、鼠、鸽子、中华鳖、鲫红细胞均有凝集作用,其中对小鼠红细胞凝集活性最强,血凝活性可达29;凝集素活性最适pH 6.0~7.4;盐度对凝集活力有较大影响,NaC l浓度在0.4~0.5 mol/L时基本失活;未纯化血清凝集素对Ca2+、Mg2+未表现出依赖性;凝集素活性能被N-乙酰葡萄糖胺特异性抑制。对青蟹血清凝集素进行硫酸铵分级沉淀分离后,发现凝集素活性主要分布在25%饱和度硫酸铵沉淀区,该组分凝集比活比血清高27.44倍,SDS-PAGE结果表明主要蛋白带型为79 ku、75 ku、72 ku。     

重组鲮GH对鲮IGF-Ⅰ表达的影响

使用半定量RT-PCR方法,研究了鲮（Cirrhinus molitorella）各组织中IGF-ⅠmRNA组织表达,并分析重组鲮GH处理后鲮IGF-Ⅰ表达变化情况。结果表明,鲮IGF-ⅠmRNA在肝组织中表达最高,其次是肾和脑,另外在肠、鳃、脾、性腺和心脏组织中也有表达,而在肌肉、皮肤中没有检测到鲮IGF-ⅠmRNA的表达;按120μg·g^-1鱼体重的剂量经腹腔注射重组鲮GH,观察12h后鲮IGF-Ⅰ表达变化情况,发现经重组鲮GH处理后,鲮肝组织IGF-ⅠmRNA表达水平显著升高,脑组织IGF-ⅠmRNA表达水平也稍有升高,而在肌肉中仍未检测到IGF-ⅠmRNA的表达;重组鲮GH处理前后,对照组中鲮血清中IGF-Ⅰ的含量为145.59±21.84ng·mL^-1,试验组中鲮血清中IGF-Ⅰ的含量为247.71±2.83ng·mL^-1,经t检验,P=0.043〈0.05,表明重组鲮GH处理前后鲮血清中IGF-Ⅰ的含量存在显著性差异。     

赤点石斑鱼神经坏死病毒主衣壳重组蛋白多克隆抗体的制备

把赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）神经坏死病毒（RGNNV）主衣壳蛋白（MCP）基因的重组表达质粒载体pRSETA-MCP转化至大肠杆菌（Estherichia coli）BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示表达的重组蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,分子量约44.5kD。通过Ni-NTA-Agarose亲和层析柱纯化,经分析纯度达90%,之后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1：12800以上。Western-blot分析结果显示,该血清与表达的重组蛋白有较强反应,说明通过原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

Development of immunodot blot assay for the detection of white spot syndrome virus infection in shrimps (Penaeus monodon)

The VP 28 gene encoding a structural envelope protein of the white spot syndrome virus (WSSV) was cloned into a pET32a(+) expression vector for the production of the recombinant VP28 protein. A purified recombinant protein of 39.9 kDa size was used for polyclonal antibody production in rabbit. Specific immunoreactivity of the rabbit anti rVP28 antiserum to the viral antigen was confirmed by a Western blot. The specificity of this polyclonal anti‐rVP28 antiserum to detect the presence of the virus in WSSV‐infected Penaeus monodon was verified using a immunodot blot assay. Immunodot blot showed a positive reaction in infected shrimp tissues with prominent colour development using 3,3′,5,5′‐tetramethylbenzidine (TMB) as a chromogenic substrate when compared with 3–3′ diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). Highest signal intensities of the immunodots were observed in infected shrimp pleopod extracts and haemolymph. On comparison with polymerase chain reaction (PCR), immunodot blot could detect 76% of PCR‐positive WSSV‐infected shrimp samples. Immunodot blot was found to be equivalent to first‐step PCR sensitivity to detect WSSV particles estimated to contain 1.0 × 10⁵ viral DNA copies.     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的截短表达及其免疫原性分析

为了揭示鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域,本研究对SVCV的糖蛋白基因进行截短表达,并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过SOSUI以及DNAStar 6.0软件对SVCV糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后,采用RT-PCR对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增,并构建重组表达质粒p GEX-Gtr,对其进行诱导表达后获得截短的SVCV糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后,作为免疫原制备兔抗血清,采用ELISA法检测其效价,采用免疫印迹以及间接免疫荧光技术检测该重组蛋白的免疫原性。研究结果显示,截短表达的糖蛋白编码基因长1317 bp,编码439个氨基酸(29~467),推测分子量为49.6 k D。利用该重组蛋白制备的兔抗血清,其与重组蛋白的反应效价为1∶64000,。免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清与SVCV-HN株能发生特异性反应,表明该重组蛋白与天然的病毒表面糖蛋白的免疫原性无差异。上述研究结果表明,截短表达的重组蛋白具有很好的免疫原性,可应用于免疫诊断技术研发与基因工程疫苗的研制。     

饲料蛋白质和能量水平对草鱼幼鱼生长和消化酶活性的影响

在水温24～29℃下,将675尾规格整齐、健康、体质量为（35.59士0.44）g的草鱼（Ctenopharyngodon idel-lus）随机分为9个处理,每处理3个重复,放养于水泥池中的网箱（100cm×50cm×100cm）内,投喂以鱼粉和豆粕为蛋白源,豆油作为脂肪源配制的3个蛋白水平（24%、28%、32%）,每一蛋白水平设3个脂肪水平（4%、6%、8%）,共计9种饲料。饲料蛋能比（P/E）在15.81-22.46 mg·kJ-1之间。92d的饲养表明：D4组（蛋白质含量为28.02%,脂肪为4.30%）草鱼的特定生长率最高,显著高于其他各组（P〈0.05）。随着饲料中蛋白含量的增加,草鱼全肠中蛋白酶的活力逐渐升高,之后又降低,以D4组饲料的蛋白酶活性最高,显著高于D1、D8和D9（P〈0.05）。本实验表明,该生长阶段的草鱼所需最适蛋白水平为28.02%,能量为14307kJ.kg-1,P/E约为19.58mg·kJ-1。     

Carp (Cyprinus carpio) lipovitellin is a highly stable phospholipoglycoprotein with the same immunogenicity as vitellogenin

Vitellogenin (Vtg) induction in carp (Cyprinus carpio) is a commonly used biomarker for oestrogenic contamination. However, the accurate quantification of Vtg was challenged because the easy degradation of Vtg standard would change the standard curves of the immunoassays. In this study, three yolk proteins were purified from carp ovarian extracts by a two‐step chromatographic method. The purified proteins were characterized as phospholipoglycoproteins with molecular weights of approximately 416, 398 and 383 kDa. In SDS‐PAGE, the purified proteins appeared as a major band of approximately 110 kDa and several faint bands. Based on these characteristics, purified proteins were identified as carp lipovitellin (Lv). Immunological analysis showed that anti‐Vtg antiserum reacted with the purified Lv. The results of stability analysis revealed that even heated at 60°C for 60 min, the electrophoretic patterns of carp Lv in native‐PAGE and SDS‐PAGE did not have a significant difference compared with the Lv solution stored at 4°C. Therefore, the purified carp Lv was confirmed to have similar immunogenicity with Vtg and possess exceptionally high stability, which would be helpful for the development of robust immunoassays for accurate quantification of carp Vtg.