常见淡水鱼肉制品快速鉴别方法的建立

近年来,随着肉制品掺假问题日益突出,特别是鱼肉制品中掺入廉价成分,混淆鱼肉品种,以次充好的掺假造假问题引起广泛关注。为解决这一问题,有必要针对常见的青鱼(Mylopharyngodon piceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)四大家鱼建立快速同时检测鱼肉制品的多重PCR方法。实验通过对青鱼D-LOOP基因、草鱼COI基因、鲢16SrRNA基因和鳙12SrRNA基因序列进行对比分析,针对特异序列设计4对引物,对特异基因进行单一PCR和多重PCR扩增,根据其特异性、敏感性建立并摸索L9(34)正交试验单管多重PCR最佳反应条件,包括引物浓度、Tm值、Mg2+浓度和模板量等,通过对PCR条件的优化,建立快速检测青鱼、草鱼、鲢和鳙四大家鱼鱼肉制品的单管多重PCR鉴定方法。结果表明,针对青鱼、草鱼、鲢和鳙4种鱼肉制品所设计的4对特异引物分别能扩增出298、210、306及639 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,4种鱼肉制品所含靶基因质粒在50 pg均可同时扩增出较清晰条带,以人工自制鱼肉制品进行了验证,结果表明所建立的方法,能够区分混合样品中4种鱼肉的构成,并对市售鱼肉制品进行检测,结果稳定。本研究所建立的方法能够简单、快速地对青鱼、草鱼、鲢和鳙4种鱼肉制品成分进行检测和监控,且特异性强、灵敏度高,可为鱼肉制品质量安全提供技术支持。     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

采用种间特异性PCR对海参产品的物种鉴定研究

运用设计出的11个种特异性PCR反向引物,通过与通用正向引物16Sar进行PCR扩增,分别在11种海参中扩增得到大小为269～406 bp的种特异性16S rRNA基因产物,而在非特异种类中扩增不出任何产物,即可有效鉴定这11种海参.此法成功检测出2种冷冻海参替代产品,即用等刺参代替仿刺参,用玉足海参代替棘辐肛参,并且...     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体病原肠杆菌PCR检测技术的建立与应用

根据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体培育期主要细菌性病原阴沟肠杆菌omp A基因序列、产气肠杆菌gry B基因序列设计特异性引物,通过对PCR扩增产物进行测序鉴定与特异性和敏感性试验,建立了两种病原菌的PCR快速检测方法,并对发病样品进行了检测。结果显示,设计的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌检测引物能分别扩增出与预计大小一致的385 bp和201 bp的特异性片段,与其余供试菌株无交叉反应。两种检测方法的灵敏度分别为103 CFU/ml和102 CFU/ml。罗氏沼虾幼体样品的检测结果与实际发病情况一致,建立的检测方法也可直接对样品进行PCR检测,而无需细菌分离培养。本研究建立的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌PCR检测方法具有较高的特异性与灵敏度,可缩短检测时间,该方法的建立对罗氏沼虾幼体病原的快速诊断、分子流行病学的调查及无特定病原(SPF)群体的建立具有重要意义。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体病原肠杆菌PCR检测技术的建立与应用

根据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体培育期主要细菌性病原阴沟肠杆菌omp A基因序列、产气肠杆菌gry B基因序列设计特异性引物,通过对PCR扩增产物进行测序鉴定与特异性和敏感性试验,建立了两种病原菌的PCR快速检测方法,并对发病样品进行了检测。结果显示,设计的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌检测引物能分别扩增出与预计大小一致的385 bp和201 bp的特异性片段,与其余供试菌株无交叉反应。两种检测方法的灵敏度分别为103 CFU/ml和102 CFU/ml。罗氏沼虾幼体样品的检测结果与实际发病情况一致,建立的检测方法也可直接对样品进行PCR检测,而无需细菌分离培养。本研究建立的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌PCR检测方法具有较高的特异性与灵敏度,可缩短检测时间,该方法的建立对罗氏沼虾幼体病原的快速诊断、分子流行病学的调查及无特定病原(SPF)群体的建立具有重要意义。     

大黄鱼性别特异SNP标记的开发与验证

大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类,其雌鱼生长显著快于雄鱼,但两性的外部形态差异不明显,也没有异形性染色体,依靠传统方法无法对其活体准确进行生理性别和遗传性别的判别与鉴定,需要开发性别特异的分子标记。本研究从2尾雌鱼和2尾雄鱼、以及分别由50雌鱼与50尾雄鱼组成的2个混合样品的基因组重测序数据比较中筛选与性别显著关联的SNP位点,对其中11个位点分别设计引物在15尾雌鱼和15尾雄鱼中扩增出PCR产物进行Sanger测序验证,鉴定出1个与性别完全连锁的位点(SNP6,15尾雌鱼均为纯合、15尾雄鱼均为杂合)。然后,设计等位基因特异性PCR引物,其中包括2条雌性与雄性通用引物和1条雄性特异引物,在闽—粤东族与岱衢族大黄鱼合计近2 200个个体中进行扩增,结果在全部雌鱼中都只扩增出1个348 bp的条带,而在全部雄鱼中还扩增出1个194 bp的Y染色体特异条带,检出率达到100%。研究表明,大黄鱼属于XX♀-XY♂类型的性别决定。本研究鉴定出一个雄性特异SNP标记,并建立了一种新的大黄鱼遗传性别鉴定技术,为大黄鱼单性育种、基因组选择育种和性别决定分子机制研究提供了重要的技术手段。     

1种快速鉴定金钱鱼遗传性别的方法

金钱鱼(Scatophagus argus)是我国东南沿海名优养殖鱼类, 具有 XY 性别决定系统, Dmrt1 是其性别决定候选基因。金钱鱼生长具有性别二态性, 雌鱼生长快于雄鱼。目前缺乏快速鉴定金钱鱼遗传性别的分子标记, 阻碍了其性别控制育种技术的建立。本研究以公布的金钱鱼基因组数据, 在 Dmrt1 附近设计多对标记引物, 并通过 PCR 扩增验证标记的性别特异性。其中, 标记引物 Dmrt1-Marker-4-F/R 在雌鱼中仅扩增出一条 593 bp X 染色体条带, 而在雄鱼中能扩增出 593 bp 和 693 bp 两条条带, 分别来自 X 和 Y 染色体, 表明该标记为共显性标记。利用该标记检测我国南海沿岸 3 个不同地理群体 213 尾金钱鱼的遗传性别与表型性别完全一致。此外, 快速 DNA 提取试剂盒提取的片段较短 DNA 样品也可用于该对标记引物准确鉴定遗传性别。本研究建立了一种快速、准确、经济可靠的金钱鱼遗传性别鉴定方法, 将旨为促进金钱鱼性别控制育种技术的建立, 并为金钱鱼性别决定与分化机制研究提供依据。     

雅罗鱼亚科鱼类(鳡鱼、草鱼及赤眼鳟)的ISSR分子鉴定

用3个ISSR引物对同为雅罗鱼亚科鱼类的鳡鱼、草鱼及赤眼鳟进行简单重复序列区间扩增(ISSR)的遗传分析.试验发现:(1)3种鱼类的种间遗传相似度以鳡鱼与草鱼之间最高(0.7157),鳡鱼与赤眼鳟之间最低(0.3041);遗传分化系数(Gst)＞0.9,且鳡鱼与草鱼的遗传分化系数最大(0.9806);UPGMA系统树显示3种鱼类分为2支,鳡鱼与草鱼首先聚在一起,最后与赤眼鳟聚类.(2)3个引物均具有种的特异性扩增带.其中引物ISSR8扩增的1550 bp和760 bp带,引物ISSR62扩增的700 bp带,引物ISSR76扩增的790 bp带为赤眼鳟的特异性谱带;引物ISSR8扩增的2000 bp和1875 bp带,引物ISSR62扩增的1380 bp带,引物ISSR76扩增的1240 bp与520 bp带为鳡鱼与草鱼的共有特异性谱带;引物ISSR8扩增的1190 bp带为鳡鱼与赤眼鳟的共有特异性谱带;引物ISSR8扩增的1340 bp与1000 bp,引物ISSR76扩增的2000 bp带为草鱼与赤眼鳟的共有特异性谱带.结果表明,鳡鱼、草鱼及赤眼鳟的遗传差异显著,分类地位至少在种的水平上,这与3种鱼的形态分类在属的水平是一致的,同时揭示了鳡鱼与草鱼的亲缘关系较赤眼鳟与二者的亲缘关系近;找到了3个引物共17条ISSR种内特异性标记和种间共享标记,可用于分子辅助分类和种质鉴定.     

鳗源创伤弧菌的鉴定与血清型分析

本研究对分离自发病鳗鲡的疑似创伤弧菌进行鉴定及血清型分析,经生化鉴定,从发病鳗鲡中得到7株创伤弧菌;设计了创伤弧菌溶血素基因(vlly)特异性引物,并对分离菌进行了PCR检测,创伤弧菌均可扩增出溶血素基因352 bp的目标片段,而非创伤弧菌未扩增出相应的片段;制备了创伤弧菌抗O抗原血清,凝集反应显示所得到的鳗源创伤弧菌抗O抗原血清不能与人源创伤弧菌1.1758发生凝集反应,菌株FJ03-X2抗O抗原血清可与大部分的鳗源创伤弧菌发生凝集反应。以上研究结果表明,基于溶血素基因设计的PCR引物具有良好的特异性,可用于创伤弧菌检测,鳗源创伤弧菌血清型不同于其他来源的创伤弧菌,菌株FJ03-X2的O抗原具有良好的免疫原性,可作为创伤弧菌疫苗研发的候选菌株。     

两种常见外来入侵赤潮藻的PCR鉴定

米氏凯伦藻与环状异帽藻为日本海域流入我国的两种外来入侵赤潮藻。利用核糖体ITS区分别设计出针对该两种藻的特异性PCR引物。通过prmier5.0软件设计多对引物,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测、以筛选目标藻的特异性引物,并以链状亚历山大藻、立玛原甲藻、牟氏角毛藻、赤潮异弯藻作为阴性对照,做进一步PCR验证。筛选到米氏凯伦藻最佳引物Ki1F3/Ki1B3和环状异帽藻最佳引物YiF3a/YiB3a。两对特异性引物成功鉴定了两种外来入侵藻,而对其它藻种则是阴性反应,可为赤潮的预测预报提供分子鉴定基础。     

赣江下游丰城江段鱼类早期资源现状调查

对赣江鱼类早期资源的调查,可为赣江鱼类资源保护以及水利工程生态调度提供科学依据.2017年5-7月,在赣江丰城段使用圆锥网采集鱼卵和弶网采集仔鱼,对鱼类早期资源种类组成、产卵规模和产卵场进行分析.结果显示,调查期间共采集鱼卵11215粒,仔鱼12645尾,隶属于4目、8科、36种,其中产漂流性卵鱼类24种.估算调查期间通过丰城段卵苗径流量为66.66×１０^８粒(尾),其中鱼卵径流量63.84×10^8 粒,鱼苗径流量2.82×10^8 尾;“四大家鱼”卵苗径流量为0.11×10^8 粒(尾),其中鱼卵径流量0.07×10^8 粒,鱼苗径流量0.04×10^8 尾.调查期间出现3次产卵高峰,集中在6 月上、中旬.各类群鱼卵数量呈现出不同的时间动态,银鮈(Squalidusargentatus)产卵高峰期主要出现在5月,银鲴(Xenocyprisargentea)、鳊(Parabramispekinensis)、赤眼鳟(Squaliobarbuscurriculus)以及“四大家鱼”则主要出现在6月.研究表明,峡江水利枢纽运行后,邻近峡江水利枢纽的巴邱“四大家鱼”产卵场消失,但其下游的仁和、新干产卵场保存较完整,在离坝较远的大洋洲镇江段新调查到一处“四大家鱼”产卵场.建议开展生态调度及增殖放流活动,以保护赣江鱼类资源.     

三峡水库生态调度对长江监利江段四大家鱼早期资源的影响

为探究生态调度对长江中游四大家鱼繁殖的影响,并了解影响家鱼产卵的关键生态水文指标的量化范围,于2013—2017年5—7月三峡水库生态调度期间在长江中游监利江段进行了鱼类早期资源调查,同时对采集到的四大家鱼卵苗与生态水文指标进行了相关性分析。结果显示,家鱼卵苗量与流量增长率呈显著正相关。每年6月下旬的生态调度,监利江段涨水持续时间为4 d及以上,流量增长率为1 600～2 833 m~3/(s·d)时,家鱼卵苗发生量较大,可占年总规模的45%以上。三峡水库生态调度涨水过程能够在一定程度上满足监利江段四大家鱼繁殖的水文需求,对减缓三峡水库运行引起的长江中游鱼类繁殖的不利影响和维持鱼类种群资源补充具有重要意义。     

捕食胁迫对“四大家鱼”幼鱼生理反应的影响

本研究选取乌鳢(Channa argus)和南方大口鲶(Silurus soldatovi meridionalis)为捕食者,青鱼(Mylopharyngodon piceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)幼鱼为猎物鱼,比较了在无捕食(空白对照)、低捕食(隔网胁迫)和高捕食(直接胁迫)压力下,胁迫0、7、14 d后,“四大家鱼”幼鱼血清皮质醇(COR)水平和血液生化指标的变化。结果显示,不同捕食胁迫水平下,“四大家鱼”幼鱼的血液生化指标和COR水平变化程度不同,但变化趋势一致。“四大家鱼”幼鱼的COR水平随着捕食胁迫程度和胁迫时长的增加显著升高,表现为无捕食组<低捕食组<高捕食组,0 d<7 d<14 d。在血液生化指标中,血清蛋白浓度和总胆固醇(CHO)浓度较为稳定,各组相比无显著变化;血糖(GLU)浓度和碱性磷酸酶(ALK)在捕食胁迫下升高,甘油三酯(TG)则相反,呈下降趋势。研究表明,“四大家鱼”幼鱼会根据捕食风险来增强自身生存能力的方式及调整生理反应。捕食胁迫处理后,“四大家鱼”幼鱼均产生了应激反应,与隔网捕食相比,直接捕食对鱼体生理反应影响更为显著,且随着胁迫时长的增加应激程度也随之增加。各检测指标中,血清蛋白和CHO可能不是捕食胁迫下鱼类应激的敏感指标;COR和GLU的变化最为显著,这可能是为了弥补应激期间机体对能量需求的增大。     

三峡库区丰都江段鱼类早期资源现状研究

探究三峡库区丰都江段鱼类早期资源现状,评估长江上游梯级水库群联合调度对鱼类早期资源的影响,可为三峡库区渔业资源管理和保护措施制定提供科学依据。2018年5-7月,在三峡库区丰都江段利用圆锥网在左岸、江心和右岸进行鱼卵、鱼苗逐日取样调查。结果显示,调查期间共采集鱼卵7426粒、鱼苗15461尾,隶属于5目、10科、40种(鱼卵16种,仔鱼36种),其中产漂流性卵鱼类19种。估算通过丰都断面的卵苗径流量为290.55×10⁸粒(尾),其中鱼卵89.84×10⁸粒,鱼苗200.71×10⁸尾;四大家的卵苗总径流量为2.24×10⁸粒(尾),其中鱼卵0.95×10⁸粒,鱼苗1.29×10⁸尾。调查期间出现3次产卵高峰,集中在5月下旬和6月下旬。各类仔鱼数量呈现出不同的时间动态,太湖新银鱼(Neosalanx taihuensis)、吻鰕虎鱼属(Rhinogobius sp.)、鲤(Cyprinus carpio)主要出现在5月,四大家鱼以及宜昌鳅鮀(Gobiobotia filifer)主要出现在6月。研究表明,三峡库区靠近库尾段的鱼类早期资源丰富,库尾江段仍存在四大家鱼产卵场。     

长江中游黄石江段四大家鱼早期资源现状

2015年和2016年每年的5—7月,在长江中游黄石江段对四大家鱼早期资源开展了调查,以了解该江段四大家鱼早期资源及产卵场分布现状。调查期间共采集四大家鱼卵67粒,苗23 948尾,种类以鲢和草鱼为主,分别占四大家鱼卵苗总捕捞数量的77.0%和18.1%。2015年和2016年,估算通过黄石江段的四大家鱼卵径流量分别为0.20×108粒、4.69×108粒,鱼苗径流量分别为19.40×108尾、13.65×108尾。黄石江段四大家鱼产卵场主要分布在团风李家洲、鄂州城区、鄂州戴家洲和黄石道士袱4个江段。与历史资料相比,黄石江段四大家鱼产卵场分布位置没有发生明显的变动。建议开展增殖放流活动,并在航道整治等工程建设中注重保护洲滩等生境。     

四大家鱼幼鱼响应模拟水轮机流道压力变化试验研究

大坝的建设阻隔了鱼类的洄游通道,鱼类通过水电站水轮机下行或误入水轮机流道有可能被流道内复杂的结构及水动力特性损伤,甚至致死。为优化水轮机流道结构及水动力特性,降低流道内鱼类的损伤概率,需明确鱼类对水轮机流道内水动力特性的响应关系,特别是河道内主要鱼种对反击式水轮机流道内压力突变的响应关系。本文以长江半洄游性鱼类四大家鱼幼鱼为研究对象,采用透明高压舱及真空泵组成的实验装置模拟轴流式水轮机流道压力变化过程对四种家鱼幼鱼的影响。实验得出,生活于河流中表层的鲢鱼和鳙鱼较生活于河流中底层青鱼和草鱼的对负压及压力梯度具有较强的敏感性;四种家鱼幼鱼均受损伤的低压阈值为20kPa;压力最低值及压力变化梯度是决定家鱼幼鱼是否受到损伤及损伤程度的关键因子。结果可以为我国长江流域上水电站水轮机的结构优化和生态运行提供技术支撑。     

基于四大家鱼产卵需求的汉江中下游生态流量研究

针对汉江中下游梯级电站开发后水文节律变化造成四大家鱼栖息地生境质量降低的问题,分别通过几种常用水文学法和栖息地模型计算了汉江中下游河道最小生态流量和四大家鱼产卵适宜生态流量,并在最小生态流量的基础上,结合四大家鱼产卵适宜生态流量以及生态水文特征在5-8月进行了脉冲设计,综合确定出了满足四大家鱼产卵需求的生态流量过程。结果表明,Lyon法和7Q10法最适宜汉江中下游最小生态流量的计算,流量为294~863 m3/s;通过栖息地模型计算,彭市和仙桃江段四大家鱼产卵适宜生态流量为1233~3950 m3/s;流量日涨幅在139.1~534.8 m3/s,持续5 d的涨水过程可为四大家鱼产卵提供良好的条件。该研究从考虑四大家鱼产卵需求的角度,为汉江中下游梯级电站的生态调度提供科学参考。     

Identification and detection of Pseudomonas plecoglossicida isolates with PCR primers targeting the gyrB region

Pseudomonas plecoglossicida is the agent of bacterial haemorrhagic ascites (BHA) in freshwater fish farming in Japan. To develop a rapid identification and detection method for P. plecoglossicida, a PCR amplification technique targeting the chromosomal DNA region coding the B subunit of the DNA gyrase (gyrB) was used. The nucleotide sequences of gyrB were determined in nine isolates of P. plecoglossicida and two other Pseudomonas species. On the basis of these determined sequences and the gyrB sequences of other Pseudomonas species or fish pathogenic bacteria deposited in international nucleotide sequence databases (GenBank/EMBL/DDBJ), PCR primers PL-G1F, PL-G1R, PL-G2F and PL-G2R were designed for specific amplification of the partial gyrB of P. plecoglossicida. The specificity of these primers in amplifying the gyrB of P. plecoglossicida was verified using selected strains of related bacterial species. The nested PCR technique was used to detect P. plecoglossicida from kidney and intestine of ayu. Primer pair PL-G1F and PL-G1R was used for the external PCR, and primer pair PL-G2F and PL-G2R for the internal PCR. Of 10 ayu juveniles, expected size PCR products were observed from intestine and kidney samples in one and two specimens, respectively. The PCR technique with primers based on the gyrB sequence is thus useful for the diagnosis of BHA.     

Molecular genetic structure and relationship of Chinese and Hungarian common carp (Cyprinus carpio L.) strains based on mitochondrial sequence

China and Hungary are major providers of the common carp (Cyprinus carpio L.) in East Asia and Europe respectively. However, the genetic variation and relationship of this species in the two countries have been poorly understood. In this study, mitochondrial COII‐tRNA^Lys and D‐loop sequences were analysed to investigate the genetic structure and relationships of the representative wild and domesticated common carps distributed in China and Hungary. The results indicated that the genetic diversities of the Chinese common carps are higher than those of Hungarian common carps, and the diversities of the wild common carps are higher than those of domesticated common carps in both the countries. Analysis of molecular variance and pairwise F_ST demonstrated a significant genetic divergence between the Chinese and the Hungarian common carps, and between the wild and the domesticated common carps. Bayesian phylogenetic analysis and statistical parsimony network showed an obvious genetic differentiation between the Chinese and the Hungarian common carps, between the wild and the domesticated common carps. However, a few specimens and haplotypes from the Chinese wild common carps appeared in the Hungarian common carps, demonstrating that there was no absolutely isolated and possible genetic linker between the Chinese and the Hungarian common carps.     

赣江峡江段四大家鱼资源现状

2008年和2009年的4-6月间，对赣江峡江段四大家鱼资源现状进行了采样调查。共采集四大家鱼392尾，其中青鱼46尾，占11.73%；草鱼260尾，占66.33%；鲢54尾，占13.78%；鳙32尾，占8.16%。在这些四大家鱼中，性成熟个体较少，其中青鱼8尾，草鱼5尾，鲢、鳙各1尾。另外，它们的年龄结构简单，以低龄鱼为主，其中1龄和2龄鱼占81.6%。结果表明赣江峡江段四大家鱼资源匮乏，繁殖群体较少。