异齿裂腹鱼Clock基因cDNA的克隆与组织表达特征

异齿裂腹鱼广布于雅鲁藏布江,产卵期为每年的3—5月,表现出明显的季节性繁殖行为,Clock基因被认为是自然选择塑造日节律以及与动物繁殖等生活史特性有关潜在的目标基因,异齿裂腹鱼Clock蛋白C末端Poly-Q长度的变异可能与其产卵开始的时间关联。以采自雅鲁藏布江的异齿裂腹鱼为对象,采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆异齿裂腹鱼Clock基因cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR对其在异齿裂腹鱼雌、雄个体不同组织中的表达特征进行分析。试验结果显示：异齿裂腹鱼Clock基因cDNA全长为4291 bp(Genbank登录号MT774361),5′非编码区为539 bp, 3′非编码区为1046 bp,编码序列为2706 bp,共编码901个氨基酸,所编码的氨基酸在末端具有典型的Poly-Q结构;Clock基因在异齿裂腹鱼雌、雄个体的肝脏、脾脏、心脏、脑、性腺和肌肉中均有表达,且以性腺中的相对表达量最高,肌肉次之,脾脏最低;Clock基因除在心脏组织中的相对表达量雄鱼高于雌鱼,在其他组织的相对表达量均表现为雌鱼高于雄鱼。异齿裂腹鱼雌、雄个体的Clock基因在性腺组织中均高表达,表...     

不同饵料对3种西藏鱼类仔鱼生长及存活的影响

研究了卤虫无节幼体、专用仔鱼料、鳗鱼仔鱼料等3种不同饵料对西藏尖裸鲤(Oxygymnocypris stewartii)、异齿裂腹鱼(Schizothorax o'connori Lloyd)、拉萨裂腹鱼(Schizothorax waltoni Regan)等3种鱼类仔鱼生长和存活的影响。实验尖裸鲤、异齿裂腹鱼、拉萨裂腹鱼仔鱼的初始全长分别为(13.29±0.52)mm、(12.29±0.44)mm、(15.81±0.50)mm,实验周期分别为25 d、25 d、15 d。结果表明:与其他饵料组相比,投喂专用仔鱼料组,异齿裂腹鱼仔鱼和拉萨裂腹鱼仔鱼的平均全长、全长增加倍数以及存活率均高于其他各组,并有显著差异;尖裸鲤仔鱼的平均全长和全长增长倍数也高于其他各组,但存活率较投喂卤虫无节幼体低,并有显著差异。     

鳜胃泌素与胆囊收缩素基因cDNA全长的克隆与表达特征

为探明鱼类消化液分泌的相关调控因子,采用RACE技术分别克隆了鳜(Siniperca chuatsi)两种肠道激素——胃泌素(gastrin,GAS)与胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)基因的cDNA序列。鳜GAS基因cDNA全长581 bp,5′非翻译区长100 bp,3′非翻译区长145 bp,开放阅读框长336 bp,编码111个氨基酸;鳜CCK具有2种类型:CCK1与CCK2,CCK1 cDNA全长为843 bp,5′非翻译区长60 bp,3′非翻译区长369 bp,开放阅读框414 bp,编码137个氨基酸;CCK2 cDNA全长846 bp,5′非翻译区长112 bp,3′非翻译区长332 bp,开放阅读框403 bp,编码134个氨基酸。鳜GAS与CCK成熟肽C末端具有相似的八肽结构(DYQGWVDF/DYLGWMDF),仅在C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量PCR分析表明,鳜GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂,CCK1与CCK2 mRNA在脑中表达量最高,在肠和幽门垂也有较高表达,表明GAS与CCK同为消化调控因子,而CCK还是神经分泌因子。鳜GAS与CCK mRNA表达贯穿于整个幼体早期发育阶段(孵化后0～22 d),前期表达水平较高,后期表达水平较低,并趋于平稳,GAS与CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。     

银鲫crh基因的克隆、组织表达谱及其对摄食的影响

为研究crh (Corticotropin-releasing hormone)基因对鱼类摄食的调控作用,首次克隆了银鲫(Carassius auratus gibelio) crh基因c DNA全长序列。运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测crh基因m RNA在不同组织的表达及餐前、餐后和禁食对其表达的影响。结果显示,银鲫crh基因的c DNA序列全长为920 bp,其中,5’-UTR为53 bp,3’-UTR为378 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为489 bp。推导银鲫crh基因的ORF区编码蛋白由162个氨基酸组成,其中,含有11个氨基酸的保守区,24个氨基酸的信号肽,41个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列的多重比较分析显示,银鲫crh基因与金鱼(Carassiusauratus)的同源性为99%,与鲤(Cyprinuscarpio)的同源性为96%。荧光定量PCR表达分析显示,银鲫crh基因在下丘脑中的表达量最高,其次是端脑和心脏。crh基因的表达量在餐前与餐后没有显著变化(P0.05),在禁食第5天、第7天出现极显著降低(P0.01),而在复投喂后第9天、第11天出现极显著升高(P0.01)。以上结果显示,crh基因在银鲫摄食调控方面可能扮演着重要角色。     

雅鲁藏布江中游6种裂腹鱼乳酸脱氢酶同工酶的比较研究

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对雅鲁藏布江中游6种裂腹鱼(尖裸鲤Oxygymnocypris stewartii、拉萨裸裂尻鱼Schizopygopsis younghusbandi、巨须裂腹鱼Schizothorax macropogon、拉萨裂腹鱼S.waltoni、双须叶须鱼Ptychobarbus dipogon和异齿裂腹鱼S.o'connori)的心肌、肌肉、肝脏、肾脏和晶状体5种组织的LDH(乳酸脱氢酶)同工酶进行比较分析。结果表明LDH同工酶的表达具有明显的组织和种间差异性。尖裸鲤、拉萨裸裂尻鱼和双须叶须鱼由LDH-A、LDH-B和LDH-B1基因编码,5种组织中分别检测到16、13和9条酶带;拉萨裂腹鱼和巨须裂腹鱼由LDH-A、LDH-B和LDH-C基因编码,5种组织中分别检测到9和6条酶带;异齿裂腹鱼由LDH-A和LDH-B基因编码,5种组织中检测到6条酶带。根据酶谱特征对其生物演化进行了探讨,发现尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼特化程度最高,其次是双须叶须鱼,巨须裂腹鱼、拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼特化程度最低,与形态学特征所划分的三个类群吻合。     

齐口裂腹鱼仔鱼饥饿试验及不可逆生长点的确定

水温17.3～21.5℃,取刚孵出的同一批齐口裂腹鱼仔鱼,暂养于2.0 m×0.8 m×0.6 m玻纤缸中,养殖到5日龄、即开口前1 d时,将仔鱼随机分为A、B、C 3组,每组500尾。6日龄A组试验鱼开口投喂,B组和C组不投喂,研究饥饿胁迫对齐口裂腹鱼仔鱼生长、发育、存活、卵黄囊吸收、摄食率及摄食强度的影响,确定齐口裂腹鱼仔鱼的不可逆生长点,即仔鱼初次摄食率低于最高初次摄食率50%时的日龄。试验结果显示,饥饿对齐口裂腹鱼仔鱼全长、体长、体高、肛前长等生长指标具有极显著影响(P0.01),对眼径、鳔等组织器官发育具有明显影响;齐口裂腹鱼仔鱼混合营养期为7 d;齐口裂腹鱼仔鱼初次摄食率约为15%,第13～14日龄仔鱼的初次摄食率达到最高值100%,17日龄仔鱼到达不可逆生长点;齐口裂腹鱼饥饿组仔鱼50%累计死亡率出现日龄为19日龄,在饥饿不可逆生长点之后。试验结果表明,齐口裂腹鱼仔鱼具有较强的饥饿耐受能力,齐口裂腹鱼最佳投喂时间为9日龄,最晚开口时间不晚于14～15日龄。     

剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)全长cDNA的克隆及表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法,克隆获得剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)基因的全长cDNA序列。剑尾鱼Vg C基因cDNA序列全长4 011 bp,其5′非编码区包含12 bp和3′非编码区包含246 bp;含有一个3 753 bp的开放阅读框(ORF),编码1 250个氨基酸,推测其编码氨基酸分子量大小为141.7 ku,编码氨基酸序列与其他鱼类卵黄白原C编码氨基酸序列相似性在44%～85%。荧光定量PCR结果显示,Vg C在剑尾鱼肝脏中表达量最高,脾、肾、卵巢中有微量表达,脑、肌肉、鳃中几乎没有检测到表达;对不同时间暴露在雌激素中剑尾鱼肝脏进行实时荧光定量PCR表达分析的结果表明,Vg C在剑尾鱼肝脏中第5天表达量最高,随后降低,第9天后维持相对较低的表达量。研究首次克隆了剑尾鱼Vg C基因全长cDNA序列,并对Vg C在剑尾鱼体内表达组织器官分布及雌激素诱导后不同时间表达谱进行了初步研究,为剑尾鱼生殖生理及环境污染物监测应用等不同领域研究打下重要基础。     

野生和养殖的异齿裂腹鱼肠道菌群结构分析

用MiSeq高通量测序技术及生物信息学分析等方法,构建体质量约1.0 kg的野生和人工养殖异齿裂腹鱼6个肠道样品肠道菌群的基因测序文库,分析比较野生和人工养殖异齿裂腹鱼肠道菌群生物丰富度及多样性差异。研究结果表明,野生组样品Y1、Y2、Y3和人工养殖组样品C1、 C2、C3测得的运算分类单元数据分别可划分为751、469、313和302、259、263;野生和人工养殖两种养殖模式下异齿裂腹鱼肠道菌群的丰富度和多样性差异不显著(P0.05);野生异齿裂腹鱼以放线菌门、变形菌门为优势菌群;人工养殖异齿裂腹鱼以蓝细菌门、变形菌门为优势菌群。野生组可分类的细菌主要是微球菌属、气单胞菌属;人工养殖组可分类的细菌主要是蓝细菌和红杆菌。本研究可为异齿裂腹鱼的健康养殖及人工养殖环境的微生态调控技术构建提供理论依据。     

齐口裂腹鱼Hsp60 cDNA克隆及其在无乳链球菌感染中的mRNA表达

齐口裂腹鱼是我国特有的亚冷水性经济鱼类,也是长江上游增殖放流的重要品种。为探究齐口裂腹鱼热休克蛋白60(Schizothorax prenanti Heat shock protein 60, SpHsp60) cDNA基因序列的分子特征和在细菌感染中的响应情况。本研究利用RACE技术克隆获得了2277 bp的SpHsp60 cDNA序列,预测编码575个氨基酸,其与脊椎动物具有较高的保守性;齐口裂腹鱼的组织表达模式分析显示,SpHsp60在肝胰脏表达量最高,血液次之,而在皮肤、肌肉和肠道中表达量低;无乳链球菌感染过程中,血液、肝胰脏、中肾和脾脏的SpHsp60 mRNA表达量在感染后6 h发生显著性变化(P<0.05),提示组织中SpHsp60能快速响应感染;且肝胰脏和中肾在感染后6 h-72 h表达量变化均显著高于对照组,而脾脏则显著低于对照组(P<0.05)。研究表明SpHsp60可能通过快速响应参与齐口裂腹鱼对抗细菌感染的过程,研究为肝胰脏和中肾组织中Hsp60 mRNA表达量作为齐口裂腹鱼感染无乳链球菌的危险信号分子提供基础数据。     

M、F型COII基因在雌雄三角帆蚌不同发育时期的表达差异研究

与传统的母系遗传不同,双壳贝类线粒体有M和F型2种mt DNA,称为双单亲遗传(doubly uniparental inheritance,DUI)。为了探究DUI的形成机制,实验利用RACE方法得到三角帆蚌M、F-type COⅡ基因的cDNA全长;荧光定量检测各时期各组织中M、F-type COⅡ基因的表达。结果发现,(1)M-type COⅡ基因的cDNA序列全长1244 bp,F-type COⅡ基因的cDNA序列全长808 bp,M型3′端较F型有一段546 bp的特异性延长序列;跨膜结构预测显示M-type COⅡ基因3′特异性延伸区域有4个跨膜结构,推测这段延伸序列具有一定的功能性;(2)早期幼龄(胚胎期-5月龄)三角帆蚌的组织团中,M、F-type COⅡ基因均能检测出,且同时期中F-type COⅡ基因的表达量显著高于M-type COⅡ;(3)6月龄蚌各组织中,F-type COⅡ基因在各组织中表达量明显高于M型的表达量,而M-type COⅡ基因在性腺中表达明显高于其他组织;(4)一龄雌性各组织中,M、F-type COⅡ基因均有表达;而一龄雄性各组织中,M-type COⅡ基因仅在性腺中表达;(5)二龄雌性各组织中,M、F-type COⅡ基因均有表达;二龄雄性各组织中,F-type COⅡ基因除性腺外的其他组织中均有低量表达,M-type COⅡ基因仅在性腺中表达,且表达量较高。研究表明,在三角帆蚌雌雄个体发育过程中,M-type mt DNA在组织中选择性降解或聚集。     

雅鲁藏布江拉萨裂腹鱼、异齿裂腹鱼及其自然杂交种的形态与COI基因条形码分析

2015年5月,在西藏雅鲁藏布江中游的桑日、朗县段水域开展鱼类调查,发现了1种疑似为拉萨裂腹鱼(Schizothorax waltoni)和异齿裂腹鱼(Schizothorax o’connori)的自然杂交种群体。形态学研究显示,该种的吻、口部、下颌、须等头部上的形态特征居于拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼之间,并明显区别于双亲,且群体中个体的头部形态稳定一致,均具有典型的中间型特征,个体间没有明显差异。基于线粒体COI基因条形码分析显示,在杂交种群体共15个样本中,有4个与拉萨裂腹鱼为同源,其余11个与异齿裂腹鱼为同源,各自间的亲缘关系很近,即杂交种群体中既有属于拉萨裂腹鱼遗传基因的个体,也有属于异齿裂腹的遗传基因的个体。综合以上研究表明,拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼在雅鲁藏布江中游的桑日等自然水域中能够自由杂交而产生后代,且两者都可以互为父母本,但以异齿裂腹鱼为母本产生的杂交种在群体中占多数,推测特殊的生态环境可能促使拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼在自然水域中容易杂交。     

西藏雅鲁藏布江中游裂腹鱼类优先保护等级定量评价

西藏地区雅鲁藏布江中游分布有6种特有裂腹鱼类,是地方重要的土著经济物种。近年来,受人类活动和环境变化的影响,裂腹鱼类资源已严重衰退而处于濒危,急需开展裂腹鱼类的资源现状调查及保护等级评价工作。本课题组分别于2015年和2017年的春季(4—5月),对雅鲁藏布江中游的渔业资源进行调查监测,参阅相关文献资料,采用珍稀性、物种价值和人为干扰共3个一级指标和5个二级指标建立优先保护等级的定量评价体系,对6种裂腹鱼类的资源状况及濒危状况进行评价,根据评分标准与优先保护综合评价值(R)确定裂腹鱼类的优先保护等级。研究结果表明,尖裸鲤(Oxygymnocypris stewartii)为一级优先保护鱼类,双须叶须鱼(Ptychobarbus dipogon)为二级优先保护鱼类,拉萨裂腹鱼(Schizothorax waltoni)和巨须裂腹鱼(Schizothorax macropogon)为三级优先保护鱼类,异齿裂腹鱼(Schizothorax o’connori)和拉萨裸裂尻鱼(Schizopygopsis younghusbandi)为四级优先保护鱼类。评价分级结果与实际情况相符,真实地反映了6种裂腹鱼类优先保护顺序。本研究对雅鲁藏布江中游的鱼类保护等级提出建议,为鱼类资源的科学保护管理等提供参考和依据。     

曼氏无针乌贼Phb2基因的克隆和其在不同生长阶段的表达分析

Phb2是抗增殖蛋白(Prohibitin)的一个亚型。本研究利用RACE技术首次获得了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Phb2基因的全长序列,该序列全长为1283 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)150 bp,3′非编码区(3′-UTR)236 bp,开放阅读框(ORF)897 bp,预测编码298个氨基酸。序列分析表明,曼氏无针乌贼Phb2基因编码的蛋白无信号肽,第20~42位氨基酸为跨膜结构,包含1个PHB家族的结构域。采用荧光定量PCR技术检测其在曼氏无针乌贼不同生长时期(幼体、产卵前、产卵中、产卵后濒死前)各组织中的表达情况,结果显示,Phb2在4个时期的各组织中均有表达,其中,幼体和濒死前表达量较低,产卵前和产卵中的表达量则相对较高,在各时期中脑、肝表达较多。视腺作为与生殖调控有关的内分泌器官,其Phb2基因表达具有时期差异性,在产卵后的表达量由产卵时期的高表达大幅下降,说明Phb2具有周期调节、控制细胞衰老和凋亡的多效性功能。本研究结果可为进一步了解抗增殖蛋白对曼氏无针乌贼的抗衰老作用提供参考。     

吉富尼罗罗非鱼Ikaros基因5''调控区的克隆、序列分析及抗无乳链球菌相关SNP位点筛选

为获得尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗链球菌病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究通过染色体步移法克隆了尼罗罗非鱼Ikaros基因5′调控区序列,长度为4178 bp,并使用生物信息学软件对Ikaros基因的启动子和转录调控元件进行预测和分析。利用PCR产物直接测序法从亲本(P0)尼罗罗非鱼Ikaros基因5′调控区中筛查到5个SNPs,分别为SNP1(g.562,GA)、SNP2(g.217,GT)、SNP3(g.–53,CT)、SNP4(g.–220,TC)和SNP5(g.–579,TC)。利用Snapshot技术对子一代(F1)尼罗罗非鱼易感群体和抗病群体进行相应SNPs的基因分型,分析两个群体遗传多样性参数,结果显示多态信息含量(polymorphism information content,PIC)值在0.0872~0.3747之间,表明Ikaros基因5′调控区中所有SNPs的多态性均较低。Ikaros基因5′调控区SNPs与抗链球菌病性状关联分析结果表明,SNP2、SNP3、SNP4和SNP5的基因型频率和等位基因频率在易感群体和抗病群体中存在显著差异(P0.05)。连锁不平衡分析结果显示Ikaros基因5′调控区SNPs可形成1个单倍块和5种单倍型,其中GGCTT单倍型与抗病性显著相关(P0.05),GGTCT和GTCCC单倍型与易感性显著相关(P0.05)。此外,还发现SNP2和SNP5处于完全连锁状态(r~2=1,LOD=57.25,D′=1),可作为罗非鱼抗链球菌病遗传育种的标签SNP。综上所述,在Ikaros基因5?调控区筛选到4个抗链球菌病相关SNPs和1个单倍型(GGCTT),均可作为尼罗罗非鱼分子育种的候选分子标记。     

Molecular characterization of cholecystokinin in grass carp (Ctenopharyngodon idellus): cloning, localization, developmental profile, and effect of fasting and refeeding on expression in the brain and intestine

Cholecystokinin (CCK) is a multi-functional brain–gut peptide in fish and mammals. To investigate the role of CCK in appetite regulation in fish, a 770-bp full-length cDNA sequence of CCK gene was obtained by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends methods in grass carp Ctenopharyngodon idellus. Homology analysis showed that the CCK cDNA sequence of grass carp had the highest similarity (90 %) to that of goldfish Carassius auratus and a higher similarity (>70 %) to those of other teleosts than to mammals. The PCR amplification using genomic DNA identified that the CCK gene of grass carp was comprised of three exons and two introns. Real-time quantitative PCR was used to detect CCK mRNA expression in adult tissues. High levels of gene expression were found in the hypothalamus and pituitary; moderate levels in the intestine, muscle and white adipose tissue; and low levels in other tissues. During early development (i.e., fertilized eggs to 35-day post-hatching larvae) the levels of CCK mRNA expression were higher during embryonic developmental stages than during post-hatch larval stages. Fasting decreased CCK mRNA expression levels in the brain and intestine, whereas refeeding resulted in an increase of expression. The results suggest that CCK mRNA expression has obvious tissue specificity and may have a role in feed intake regulation in grass carp.     

低频声波频率下瘤背石磺CaM-like、CaMKII基因的表达及功能

长期栖息于潮间带的动物能够感知当地的潮汐规律,形成潮汐记忆的能力。本研究以栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)为对象,研究其通过感知潮汐来临时产生的低频声音来调节其行为与潮汐节律相协调的分子机制。通过RACE-PCR技术克隆到CaM-like基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaM-like基因的cDNA全长2321 bp,包括5′非编码区(UTR)366 bp,3′非编码区(UTR)1337 bp,618 bp的开放阅读框编码206个氨基酸;预测该基因编码的多肽链的原子数量是3165,分子量约为23029.64 kD,理论等电点4.64,分子式是C_(1018)H_(1544)N_(274)O_(320)S_9。N端信号肽由29个氨基酸组成。氨基酸序列比对构建系统进化树,结果显示瘤背石磺CaM-like基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的CaM-like基因的亲缘关系最接近,这与传统形态学分类相吻合。在实验室内模拟潮汐中低频声音刺激瘤背石磺,应用qRT-PCR检测CaM-like基因在不同组织的分布情况,结果显示CaM-like mRNA在瘤背石磺不同组织均有表达,但神经节部位的表达量显著高于背部皮肤、腹足、肠、肝胰腺、口器和蛋白腺等组织(P0.05),推测其可能参与神经系统的可塑性调节。荧光定量结果显示CaM-like、CaMKII基因分别在25 Hz和50 Hz低频声波下刺激12.4 h表达量较高,初步推测其能感知25～50 Hz声波频率。这可能与栖息于潮间带中的瘤背石磺长期感知12.4 h半日潮潮汐周期节律,形成潮汐记忆有关。本研究将为进一步深入了解瘤背石磺感知潮汐节律的分子机制奠定基础,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供依据。     

鲤lipea基因表达的时空特征及与脂肪沉积相关性分析

本文旨在克隆鲤(Cyprinus carpio)激素敏感性脂肪酶a (hormone-sensitive lipase a, lipea)基因,探究其时空表达特征及其与脂肪沉积的关系,以期为鲤脂肪沉积分子调控机制研究奠定理论基础。本实验采用RACE技术克隆获得鲤lipea基因,其cDNA全长为3379 bp,包括230 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、1067 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码693个氨基酸的开放阅读框。多序列比对显示,鲤lipea与斑马鱼(Danio rerio)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的氨基酸序列相似性分别为88.17%、64.94%和63.35%,不同物种间序列差异主要集中在C-端的多肽序列上。蛋白质结构分析显示该蛋白含有3个功能域分别具有脂肪酶活性、乙酰基水解酶活性和水解酶活性。应用实时荧光定量PCR技术分析了lipea基因在鲤各组织、不同发育时期以及脂肪含量极端差异个体的肌肉和脂肪组织中mRNA表达量的变化。结果显示, lipea在各组织中均有表达,腹腔脂肪中相对表达量最高,其次是腹部肌肉,血液中最少。随着胚胎的发育, lipea的表达水平呈现下降趋势, 8细胞期表达量最高,其次是囊胚晚期,开口期最少。lipea表达量与背部肌肉脂肪含量呈正相关,但差异不显著(P0.05),与腹腔脂肪量呈负相关,且差异极显著性(P0.01),推测lipea基因对鲤腹腔脂肪沉积可能具有抑制作用。本实验结果可为进一步解析鲤lipea基因的功能和基因调控脂肪沉积分子机制研究提供参考。     

饥饿及再投喂处理对草鱼生长、葡萄糖代谢和转运蛋白1表达的影响

设置持续投喂组(C,持续投喂8周)、饥饿再投喂组(R,饥饿4周+再投喂4周)和持续饥饿组(S,饥饿8周)3个处理组,研究3种不同饥饿处理对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)血清生化指标、糖原和糖代谢相关酶和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的影响,同时在此实验基础上研究草鱼在急性高糖负荷胁迫下的糖耐受能力、糖代谢相关酶和GLUT1的变化规律,旨在阐明草鱼在饥饿及再投喂处理条件下的糖代谢特征。选取初重为(125.35±0.54)g的草鱼,饲养8周后以30 mg/100 g体重的剂量腹腔注射葡萄糖研究其糖耐受能力。结果显示,S组肝糖原和血清的血糖、甘油三酯含量均最低。饥饿处理对草鱼糖耐受能力影响显著,S组血糖含量在各时间点上显著低于其余两组(P0.05),肝糖原在6 h达到峰值;饥饿处理对草鱼肝脏糖代谢关键酶影响显著,饥饿处理(S组)诱使磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)活性上升但抑制丙酮酸激酶(PK)和果糖-6-磷酸激酶(PFK)的活性(P0.05),而饥饿再投喂(R组)后PEPCK、PK和PFK酶活性恢复到持续投喂(C组)处理水平。注射葡萄糖后S组肝脏GK酶活性增幅最大,PK酶活性呈上升趋势,而R组则呈先下降后上升的趋势;饥饿处理对草鱼肝脏和肌肉GLUT1表达影响显著,注射葡萄糖后,除R组肝脏组织外,其余各组草鱼肝脏和肌肉组织GLUT1表达量均呈先上升后下降的趋势,且S组肌肉GLUT1表达量在各个时间点上均高于其余两组(P0.05)。研究结果表明,在不同饥饿处理下,草鱼可通过消耗肝糖原和甘油三酯及降低肝脏糖酵解相关酶(PK和PFK)活性和促进糖异生PEPCK酶活性来应对饥饿胁迫,而饥饿处理可诱使GK和PK酶活性上升、促进糖原合成和激活GLUT1基因的表达和转运来缓解草鱼急性高糖负荷,从而提高其糖耐受能力。     

三疣梭子蟹心激肽基因克隆及在低盐适应中的功能验证

采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)心激肽(CCAP)基因。该基因全长606 bp, 5￠端非编码区72bp,3￠端非编码区108bp,开放阅读框426bp,编码141个氨基酸,预测分子量15.6kD,理论等电点9.55。同源性分析表明,三疣梭子蟹CCAP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和蓝蟹(Callinectes sapidus)的CCAP同源性较高,分别为85%和82%。系统进化树分析显示,三疣梭子蟹与蓝蟹首先聚为一支,之后再与拟穴青蟹相聚。组织表达分析发现, CCAP基因在胸神经节中的相对表达量最高,其次是脑和眼柄组织。通过分析CCAP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐可显著改变CCAP在胸神经节中的表达模式,在24 h, 48 h和72 h实验组的表达量显著高于对照组(P0.05),分别为对照组的1.73, 2.16和2.19倍。体外注射CCAP多肽可降低三疣梭子蟹在低盐条件下的死亡率,并诱发钠钾ATP酶(Na~+/K~+-ATPase)和V型ATP酶(V-ATPase)酶活力显著提高。本实验结果暗示CCAP通过调控Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase活力以达到盐度适应的作用。     

中华绒螯蟹Smad3(EsSmad3)的cDNA克隆、序列分析及表达特征

为了研究Smad基因在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Smad3(命名为Es Smad3)的cDNA全长序列2021 bp,包括36 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、656 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码442个氨基酸的开放阅读框。蛋白质结构域分析显示EsSmad3含有MH1和MH2两个特征性保守结构域。多序列比对显示,EsSmad3与人、斑马鱼、黑腹果蝇中的同源蛋白序列一致性分别为0.679、0.691、0.619。应用荧光定量RT-PCR技术分析EsSmad3在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Smad3在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中眼柄和精巢中表达量较高,心脏和肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期的不同部位的肌肉中,Es Smad3表达量变化不同:步行足肌肉组织中EsSmad3 mRNA表达在蜕壳间期高于蜕壳前D_(3–4)期和蜕壳后A~B期,但无显著的统计学差异(P0.05)。螯足肌肉在蜕壳前晚期D_(3–4)期急剧下调(P0.05),蜕壳后A~B期开始表达量显著升高(P0.05),直至蜕皮间期C期。腹部肌肉组织中EsSmad3m RNA水平在蜕皮间期C期显著高于蜕壳后A~B期,这种上调一直持续到蜕壳前晚前期D_(3–4)。上述结果表明,Es Smad3在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达模式与蜕皮周期密切相关,推测Es Smad3参与了中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。