三角帆蚌alpha-2巨球蛋白cDNA全长的克隆及表达特征

alpha-2巨球蛋白是河蚌体内重要的天然免疫因子,参与广泛的免疫防御和调节.通过RACE法克隆了三角帆蚌α2M全长cDNA序列,提交Genbank,获得核苷酸序列登陆号:DQ 993157.1.同时,采用生物信息学方法对alpha-2巨球蛋白进行了系统分析.该基因cDNA全长5 124 bp,其中编码区4 836 bp,5'端非编码区35 bp,3'端非编码区为253 bp(含polyA尾31 bp),该基因能编码1 611个氨基酸,其中前23个氨基酸残基为信号肽序列,成熟蛋白分子量为177 571.8 u,等电点为5.49.蛋白的不稳定系数为39.53,表明该蛋白是稳定的.在此基础上,以18 S作为内标,利用半定量RT-PCR法检测α2M基因在三角帆蚌不同组织和不同生理状态下的表达情况.结果表明,alpha-2巨球蛋白仅在血细胞中有表达,而在外套膜、闭壳肌、肠和性腺中没有表达.经注射大肠杆菌和嗜水气单胞菌12 h后,三角帆蚌体内α2M的表达水平都有一定量的升高,证明α2M是三角帆蚌基础免疫系统中的组成部分.本研究丰富了软体动物免疫学研究内容,为三角帆蚌抗病机理提供理论资料.     

三角帆蚌hcSRCR1基因的克隆及在不同壳色选育系中的表达模式

清道夫受体(SR)是一类对化学修饰的脂蛋白具有很强结合活性的糖蛋白家族。本研究通过RACE方法克隆得到三角帆蚌hcSRCR1基因cDNA序列,该序列全长1 000 bp,其中开放阅读框819 bp,编码272个氨基酸,预测分子量为28.16 ku,理论等电点为5.55;预测含有2个SRCR结构域和6个保守的半胱氨酸残基。qRT-PCR和Western blot结果显示,hcSRCR1 mRNA和蛋白表达模式基本相同,均在三角帆蚌外套膜中表达量最高,在其他组织中的表达量普遍较低,且在紫色选育系外套膜组织中的表达量显著高于白色选育系。外套膜原位杂交结果显示,hcSRCR1基因主要在外套膜外褶的内、外上皮细胞层以及腹膜处的上皮细胞层中表达。研究表明,三角帆蚌hcSRCR1基因与贝壳珍珠质颜色形成具有一定相关性,可为进一步研究该基因在珍珠颜色形成过程中的调控机理提供基础资料。     

三角帆蚌HcCUBDC基因cDNA的全长克隆与表达分析

利用cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）方法,获得了三角帆蚌HcCUBDC基因的全长cDNA序列,共5158bp,开放阅读框（ORF）1920bp,编码639个氨基酸,5′端非编码区576bp,3′端非编码区2662bp,GeneBank登陆号为KP067952。生物信息学分析表明,三角帆蚌HcCUBDC蛋白含有一个由19个氨基酸组成的信号肽和4个CUB结构域,但未能比对上已知的蛋白。经荧光定量PCR检测,HcCUBDC基因在紫色和白色蚌前端缘膜、后端缘膜、中央膜、鳃、斧足、肝胰腺、肠和肾8个组织中均有表达,并且都是肝胰腺表达量最低。在紫色蚌中,后端缘膜表达量极显著高于前端缘膜;在白色蚌中,前端和后端缘膜之间表达差异不显著。HcCUBDC基因在紫色蚌后端缘膜中的表达量极显著高于白色蚌,在紫色和白色蚌前端缘膜中的表达量差异不显著。外套膜原位杂交结果显示,HcCUBDC基因主要在缘膜外上皮细胞中表达。研究表明,HcCUBDC基因在三角帆蚌内壳色形成中发挥作用,可为进一步深入研究该基因在珍珠颜色形成过程中的功能及其调控机理提供基础资料。     

三角帆蚌kinase X基因的克隆及功能初探

三角帆蚌是我国特有的淡水育珠蚌,在养殖业中占有重要地位,在实际养殖过程中,雄性个体有着明显的产珠优势,因此对性别决定的相关研究至关重要。研究发现Sox9基因在许多物种中起到性别决定的作用,kinase X基因是蛋白激酶(PKA)合成中至关重要的基因,而Sox9基因很可能受到PKA激酶的调控。实验通过RACE法克隆kinase X基因的全长cDNA序列,使用荧光定量PCR的方法检测该基因在2龄雌雄三角帆蚌各组织中的相对表达量,利用RNA干扰技术研究干扰链对kinase X基因及下游基因Sox9基因表达的影响。结果显示,kinase X基因全长1 652 bp,编码430个氨基酸;荧光定量PCR结果显示,kinase X基因在雄性性腺中表达量最高,雌雄间差异极显著;RNA干扰结果显示,合成的干扰链均对kinase X基因有着一定的干扰效率,其中干扰链1的干扰率最高,在雌性中的干扰率为83.1%,雄性中为81.9%,同时干扰链1干扰后Sox9基因的表达量在雌性中下降了90.3%,雄性中下降了56.6%,推测这两个基因可能参与性别决定过程。本实验为三角帆蚌性别决定和雄性单性化育种研究提供理论基...     

背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因cDNA全序列克隆及表达分析

采用RACE方法,克隆了背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因的cDNA全序列。结果显示,该cDNA序列全长为870 bp,5'端非翻译区104 bp,3'端非翻译区460 bp,开放阅读框长为306 bp,共编码101个氨基酸,相对分子量为11 166.9 u。同源性分析显示,该基因编码的蛋白与三角帆蚌theromacin基因氨基酸序列的相似度最高,为73%;与贻贝中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins等4种类型相似度较低,属于Macin家族(登录号:KJ598604)。实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足和肠等组织中均有表达,在外套膜中的表达量最高,在其他组织中的表达量较低;经嗜水气单胞菌诱导后,各个组织的表达量出现明显上调的趋势且与对照组显著差异,推测theromacin基因可能在背角无齿蚌的免疫反应中起重要作用。     

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的分子特征与表达分析

为研究淡水珍珠形成相关基因及调控机理,以三角帆蚌为研究对象,借助cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了三角帆蚌的钙网蛋白基因(calreticulin,HcCRT) cDNA序列,该序列长1 437 bp,包含231 bp的5'非编码区(untranslated region,UTR)和615 bp 3'UTR以及591bp的开放阅读框(ORF),共编码196个氨基酸残基,包含一段由21个氨基酸组成的信号肽和一段由175个氨基酸的成熟肽,分子量约为22.4 ku,理论等电点5.01.氨基酸序列分析表明,该序列不存在跨膜结构,疏水性分析显示该蛋白整体为亲水性蛋白.氨基酸列比对分析显示,HcCRT具有保守的钙网蛋白家族结构,具有2个保守的钙网蛋白家族标签序列:KHEQNIDCGGGYLKVF和IMFGPDICG,与其他已知物种的CRT具有较高保守性,其中与斑马鱼的相似度为77％,与长牡蛎和马氏珠母贝的相似度为70％.对三角帆蚌HcCRT蛋白序列的二级结构和三级结构进行预测分析,显示该蛋白同时含螺旋和折叠.实时荧光定量PCR分析结果显示,HcCRT在外套膜、血液、鳃、斧足、肝脏、肾脏、肠和闭壳肌等8个组织中均有表达,其中在外套膜中表达量最高,血液次之,在其他组织的表达量极少.初步推测HcCRT参与了三角帆蚌珍珠形成的生物矿化过程.     

黄鳝PLA2基因的克隆及表达分析

利用同源克隆技术和RACE技术克隆黄鳝(Monopterus albus)磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA全长;并采用荧光定量RT-PCR法检测PLA2基因在黄鳝各组织中的表达量情况。结果显示:黄鳝PLA2基因全长cDNA大小为2 606 bp(Gen Bank登录号:KX852397),其中开放阅读框2 205 bp,编码736个氨基酸,预测分子大小为83.623 kD,理论等电点5.84;5'和3'非编码区长度分别为208 bp和193 bp。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构。氨基酸序列比对和系统树分析显示,黄鳝PLA2基因的结构十分保守,黄鳝与大黄鱼和金头鲷的PLA2基因亲缘关系最近,与鼠类和蟾蜍的亲缘关系较远。RT-PCR分析表明,PLA2基因在组织中的表达具有组织特异性,在消化器官前肠组织中的表达最高,在性腺及肌肉组织中表达很少。     

三角帆蚌溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1HcLPCAT1基因功能分析及壳色性状相关SNP筛选

溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 1(LPCAT1)是一种重要的脂质代谢酶。为明确三角帆蚌(Hyriopsis cumingii) HcLPCAT1 基因在类胡萝卜素代谢中的功能, 探究该基因与三角帆蚌壳色的相关性, 本研究采用 RACE 技术克隆获得 HcLPCAT1 基因 cDNA 全长 1675 bp, ORF 区 1296 bp 编码 431 个氨基酸; 实时荧光定量分析发现 HcLPCAT1 基因在紫色三角帆蚌各组织中表达量均高于白色三角帆蚌相应组织, 且在肝胰腺、外套膜中的表达量差异显著 (P＜0.05); 原位杂交检测到的阳性信号主要定位在外套膜的外褶、背膜区、腹膜区, 外褶与中褶连接处以及部分中褶; 紫色三角帆蚌补充投喂 β-胡萝卜素后, HcLPCAT1 基因在肝胰腺、中央膜、边缘膜各组织中表达量极显著上调 (P＜0.01), 同时相应组织中总类胡萝卜素含量(TCC)极显著升高(P＜0.01)。采用直接测序法鉴定出三角帆蚌 HcLPCAT1 基因 5 个 SNP 位点的基因型与内壳色存在显著相关性(P＜0.05), 单倍型分析发现 H1、H2 两种单倍型为紫色三角帆蚌优势单倍型, H3、H5、H6 三种单倍型为白色三角帆蚌优势单倍型。本研究鉴定的 HcLPCAT1 基因可为解析三角帆蚌类胡萝卜素代谢和壳色形成的机制提供研究基础, 筛选的与内壳色相关 SNP 及单倍型可用于分子辅助育种。     

三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列克隆及表达研究

为了发掘更多三角帆蚌具有EF-hand结构域的功能基因及其蛋白质,本研究运用RACE-PCR技术,克隆得到了三角帆蚌包含EF-hand结构域钙结合蛋白1基因(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)的cDNA全长并进行了生物信息学分析;通过real-time Q-PCR技术,分析了EFCB1基因在三角帆蚌10个组织,以及内脏团、外套膜插核后不同时间点的时空表达特点。结果表明三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列全长981 bp,ORF为531 bp,编码176个氨基酸残基,5'-UTR 239 bp和3'-UTR 211 bp。EFCB1分子式为C₈₇₇H₁₃₄₈N₂₃₈O₂₇₀S₁₀,分子量约19.9 ku,等电点为4.70,不稳定系数为62.65,属亲水蛋白。其序列无信号肽序列,存在1个跨膜区域和2个EF-hand结构域,EF-hand模块分别为DLNDDKLISPEE(98-109)和DTNGDDKLDGEE(129-140)。荧光定量结果显示三角帆蚌EFCB1基因在各组织中均有表达,其中在肠和鳃中表达量最高(P<0.05),外套膜中表达量显著高于内脏团(P<0.05)。EFCB1基因在插核后不同时期的外套膜和内脏团育珠部位组织中表达具有显著差异(P<0.05),在外套膜中的表达量均显著高于内脏团(P<0.05),在插核后第20 天时表达量显著高于各时期(P<0.05)。研究表明,EFCB1在三角帆蚌Ca²⁺的吸收过程中发挥调节作用,在珍珠囊形成过程中以及珍珠形成初期具有重要功能。     

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RTPCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1 483 bp,由长92 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257 bp的3′非翻译区,和1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9 ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%~99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。     

三角帆蚌活化蛋白激酶C受体1基因(HcRACK1)的克隆及表达分析

为了探究RACK1基因在三角帆蚌免疫系统中的调控机制,采用RACE技术克隆得到三角帆蚌RACK1基因(命名为HcRACK1)的c DNA全序列,并对该序列进行分析。结果显示,HcRACK1基因全长为1249 bp,其中开放阅读框957 bp,编码318个氨基酸。蛋白质结构域分析显示HcRACK1含有RACK1家族特有的7个WD40结构域。运用荧光定量PCR技术分析HcRACK1在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染和重金属镉暴露后相关组织表达量的变化。结果显示,HcRACK1在各个组织中均有表达,其中闭壳肌中表达量最高;嗜水气单胞菌侵染后,HcRACK1在血淋巴中的表达量逐渐上升,24 h时达到峰值,随后下降;暴露在100μg/L浓度的重金属镉中,HcRACK1在肝胰腺中的表达量逐渐上升,在第3天达到峰值;血淋巴在第2天达到峰值,随后下降;鳃中HcRACK1的表达量无明显变化。上述结果表明,Hc RACK1与细菌及镉引起的机体的氧化应激反应有关,并能参与到机体的免疫反应中。     

RAPD分析野生和养殖三角帆蚌的遗传多样性

用150个随机引物对野生三角帆蚌和养殖三角帆蚌进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析，最终筛选出2．0个引物，分别能扩增出1-10条大小不等的片段，片段长度在500—2000bp之间。野生三角帆蚌和养殖三角粤蚌的种内相似系数分别为0．787和0．833，显示野生种群基因组发生的变异较养殖种群大。野生三角帆蚌和养殖三角帆蚌种群间遗传距离为0．054，表明三角帆蚌野生和养殖种群亲缘关系比较接近。     

虾夷扇贝线粒体遗传模式的初步研究

动物线粒体遗传模式主要为母系遗传。近年来在一些双壳类（如贻贝科、蚌科和帘蛤科）中发现了线粒体双重单亲遗传现象。双重单亲遗传完全不同于传统的母系遗传模式，它开启了一种独特的系统来检测进化力在线粒体基因组中的作用。但双重单亲遗传是否广泛存在于双壳类尚属未知。文章研究了虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）的线粒体遗传模式，结果显示，同一个体中体细胞和性腺的线粒体片段的基因型不存在差异；家系检测中也显示子代的线粒体单倍型与母本一致；在虾夷扇贝线粒体中未发现双重单亲遗传现象。     

三角帆蚌不同组织基因组DNA提取效果比较

利用平衡酚-氯仿法分别提取三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)斧足、鳃、闭壳肌、性腺、肝脏、心脏中的基因组DNA,采用紫外分光光度测定法、琼脂糖凝胶电泳法、PCR扩增法分析三角帆蚌不同组织基因组DNA的提取质量。结果表明,三角帆蚌6个组织均能成功地提取基因组DNA,但提取的DNA质量存在差异;斧足中提取的DNA纯度、浓度最高,PCR扩增的条带最亮,因而是三角帆蚌提取DNA的最佳组织;其次是肝脏和闭壳肌,心脏和性腺提取的DNA较差。     

半滑舌鳎线粒体 DNA 含量测定方法的建立与优化

本研究旨在应用实时荧光定量PCR技术,建立半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)线粒体DNA(mtDNA)含量测定方法并进行优化.通过质粒标准品的线性化处理、模板DNA的酶切和超声处理、mtDNA和核DNA(nDNA)基因引物的筛选实验,建立半滑舌鳎mtDNA含量测定方法.结果表明,质粒标准品的构象对荧光定量PCR标准曲线影响较大,线性化的质粒更适合用作标准品;酚-氯仿方法提取的模板DNA适用于mtDNA含量测定,无需进行预处理;用D-loop和ND1这2对引物所得的拷贝数较小且结果一致,适用于mtDNA拷贝数的测定;以不同核基因为参照所得的mtDNA含量可能存在差异,当以单拷贝核基因ENC1和MYH6为参照时,可以计算出单个细胞中mtDNA含量,若以多拷贝基因GAPDH为参照,mtDNA含量测定值则较小.采用本方法分别对半滑舌鳎肝、肾、脾和肌肉组织的mtDNA含量进行重复性检测实验,结果表明,相同组织的mtDNA含量显示出良好的重复性(P＞0.05),而不同组织中mtDNA含量具有差异性,可见该方法稳定可靠,能为海洋鱼类mtDNA含量检测提供借鉴.     

颈链血苔虫线粒体基因组的测定及其系统发育学意义

本研究测定了颈链血苔虫的线粒体基因组。它是一个双链闭合环状分子,全长14144bp,与其他后生动物相比相对较小;颈链血苔虫线粒体基因组所有的基因都编码在同一条链上。相比其他后生动物它具有独特的基因排列顺序,而且与已发表的两个苔藓动物线粒体基因组相比,基因排列顺序也显著不同,这说明苔藓动物线粒体基因组经历了大规模的基因重排过程。基因排列顺序比较分析的结果支持苔藓动物为原口动物的观点,提示我们基因排列顺序的比较分析可能会成为苔藓动物门进化地位确定的良好途径。     

应用激光共聚焦显微技术研究Ca2+在三角帆蚌组织内的积累与分布

为了探讨淡水贝类Ca2+吸收和转运信号传递机理,采用激光共聚焦技术研究了三角帆蚌不同组织细胞在静息状态下细胞内游离Ca2+浓度,以及水体Ca2+浓度对外套膜组织细胞内钙沉积的影响。试验选取10只健康的三角帆蚌,分别获得外套膜外膜、内膜、斧足、腮及内脏团上表皮组织细胞,短期培养后用Fluo-3/AM荧光探针孵育细胞1 h,观察细胞内Ca2+荧光强度。研究结果表明,蚌不同组织细胞内Ca2+荧光强度存在显著差异,外套膜外膜细胞内Ca2+荧光强度最高,内脏团上表皮细胞的最低(P<0.05);育珠三角帆蚌在相同Ca2+浓度的孵育水平下,外套膜细胞内Ca2+荧光强度比非育珠蚌都有增加的趋势,其中在1.25 mmol/L添加组中,两组外套膜内膜细胞内Ca2+荧光强度差异达到显著水平(P<0.05);不同Ca2+孵育水平对细胞内Ca2+荧光强度有显著影响(P<0.05),随着Ca2+在孵育液中浓度的升高,外套膜细胞内Ca2+荧光强度显著增强(P<0.05),表明外套膜是从外界吸收Ca2+的主要组织,蚌体珍珠的培育增强了其对Ca2+的沉积,并且水体Ca2+浓度在1.25～3.00 mmol/L有助于蚌体内Ca2+的贮藏,这对进...     

中华鲟piwil1基因的克隆表达特征研究

Piwi是鱼类配子发生和性腺发育的重要调控因子。本研究从中华鲟(Acipenser sinensis)性腺中克隆得到了piwi基因的全长c DNA序列,该序列长3 393 bp,开放阅读框为2 583 bp,编码860个氨基酸。氨基酸序列多重对比发现,该序列具有PAZ和PIWI保守结构域,与其他鱼类piwil具有较高同源性;系统进化分析显示,中华鲟piwil聚于piwil1分支;因此,所得序列为piwi-like 1基因,命名为Aspiwil1。荧光定量PCR研究表明,Aspiwil1为母源表达,且其表达量随着胚胎发育逐渐降低;Aspiwil1在性腺中大量表达,在脑组织中也有较低水平的表达。性腺组织切片RNA原位杂交结果表明,Aspiwil1仅在生殖细胞表达,且其杂交信号随着卵子发生逐渐增强、精子发生逐渐减弱。本研究为中华鲟配子发生过程中Aspiwil1的功能研究提供了基础。