太平洋牡蛎微卫星引物对三角帆蚌的适用性研究

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国特有种，它形成的珍珠具有珠质光滑细腻、色泽鲜艳等方面的优点，是淡水蚌中育珠质量最佳者，已成为最主要的淡水养殖珍珠蚌。本研究选取已发表的32对太平洋牡蛎的微卫星引物在三角帆蚌基因组DNA中进行PCR扩增，探讨太平洋牡蛎的引物用于三角帆蚌基因组微卫星分析的可能性。通过优化PCR反应条件，筛选13对引物可在三角帆蚌基因组中扩增出特异性条带（占总数的4l％）；其中10对引物（占总数的3l％）在洞庭湖三角帆蚌小群体中即检测到了个体间等位基因的多态性，共出现40条多态性条带。10个位点杂合度大小在0．125到0．693之间，其中7个微卫星位点（Cgi-10，Cgi-22，Cgi-24，Cgi-26。Cgi-29，Cgi-30，Cgi-32）为高度多态性位点，杂合度大于0．500，而其余3个微卫星位点（Cgi-1，Cgi-18 and Cgi-25）杂合度小于0．500，为低度多态性位点。初步的结果表明，部分太平洋牡蛎的微卫星引物可以用于三角帆蚌基因组的分析，这为其它贝类微卫星标记的开发奠定了基础。     

三角帆蚌微卫星位点筛选及多态性分析

采用磁珠富集法,以生物素标记的(CA)10寡核苷酸为探针,构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)基因组微卫星富集文库。根据微卫星位点的侧翼序列设计引物,随机挑选扩增出与预期大小相符的32对引物,引物荧光标记后对24个三角帆蚌个体分别进行PCR扩增,共筛选出20对多态性较好的引物。结果表明,20个微卫星位点的等位基因数为5～20,有效等位基因数2.321 3～13.260 3。观察杂合度和期望杂合度分别为0.318 2～1.000 0和0.582 5～0.946 1;PIC值0.547 2～0.919 9;其中14个位点符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。本研究筛选的20个微卫星标记可作为三角帆蚌遗传多样性、种群遗传结构等研究的理想分子标记。     

2种育珠蚌遗传多样性分析

采用ＲＡＰＤ和同工酶凝胶电泳的方法，对三角帆蚌和褶纹冠蚌的遗传多样性进行了分析。结果显示，三角帆蚌群体内的相似度为０．２９１７，褶纹冠蚌的为０．３６３６；两者的群体间相似系数为０．６７２３，遗传距离为０．３２７７。ＥＳＴ和ＬＤＨ同工酶在褶纹冠蚌外套膜及内脏团组织中的表达酶谱均比在三角帆蚌中复杂，２种组织相比则内脏团中的表达酶谱比外套膜复杂。三角帆蚌和褶纹冠蚌同作为亲缘关系比较接近的主要育珠蚌种，两者各有优缺点。在珍珠养殖和育种上，一方面要重视野生资源的保护，避免近亲繁殖；另一方面要建立种质资源库，不断筛选出更多更好的优良性状，提高育珠的质量和产量。     

三角帆蚌微卫星富集文库的构建、鉴定及多态性分析

通过磁珠富集法构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)微卫星富集文库。共获得800个阳性克隆,其中的100个阳性克隆经测序分析,共获得微卫星序列54个。利用这些微卫星序列可设计33对引物,经过PCR扩增筛选获得了25对可用引物。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对洞庭湖1个种群的30只三角帆蚌进行扩增,发现13对引物呈现多态性,等位基因数在4～9。观测杂合度在0.2543～0.9827,期望杂合度在0.3629～0.8217,信息多态含量平均为0.5198。由于存在无效等位基因,两个微卫星基因座(GenBank登录号为GQ302651和GQ302658)明显地偏离哈代-温伯格平衡,但没有发现连锁不平衡现象。这说明利用磁珠富集法构建的三角帆蚌微卫星文库质量较好,13对多态性微卫星引物可为三角帆蚌微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供帮助。     

福建官井洋大黄鱼AFLP指纹多态性的研究

对福建官井洋大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)野生种群和2个养殖群体进行5对选择性引物(共37个标本)的AFLP分析。结果表明,共检出503个不同的扩增片段(50～450bp),每对引物扩增出的片段数目为76～155个;在5对引物检出的扩增片段中,101个(20.1%)为全部37个受试个体共有,312个(62.0%)为部分野生与养殖个体共有,53个(10.5%)仅见于野生个体,37个(7.4%)仅见于养殖个体,养殖群体中出现野生种群所没有的扩增片段;野生种群、养殖1、养殖2多态片段比例分别为76.6%、70.6%、69.2%,遗传差异度分别为0.2464、0.2322、0.2299,养殖群体多态片段比例与个体间的遗传差异度均低于野生种群。养殖群体的遗传多样性水平较低,遗传变异相对贫乏。     

三角帆蚌HcTyr基因内壳色性状相关SNP筛选及图谱定位

为研究三角帆蚌HcTyr基因与内壳色性状的相关性,本实验根据已分离的三角帆蚌HcTyr基因进行引物设计和片段扩增,并用144只三角帆蚌对其多态性进行筛选和验证,卡方检验分析了SNP位点和三角帆蚌内壳色相关性,并对HcTyr基因进行了图谱定位。结果显示,在HcTyr基因上筛选出8个SNP位点,其中有7个SNP位点与三角帆蚌内壳色L、a及d E呈显著相关性,用这7个SNP位点做单倍型构建和分析,发现Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ这3种单倍型在白色群体中出现的频率极显著高于在紫色群体中出现的频率,而Ⅴ和Ⅶ这2两种单倍型在紫色群体中出现的频率极显著高于白色群体。进一步在商业养殖群体中验证发现,Ⅳ和Ⅶ这2种单倍型可分别作为白色和紫色群体的优势单倍型。研究表明,三角帆蚌HcTyr基因可作为内壳色相关的候选基因,其部分SNP位点可用于三角帆蚌分子辅助育种。另外本实验还将HcTyr基因定位在三角帆蚌LG16连锁群上,这为进一步解析该基因调控珍珠颜色形成的分子机制奠定了基础。     

2种育珠蚌遗传多样性分析

采用RAPD和同工酶凝胶电泳的方法,对三角帆蚌和褶纹冠蚌的遗传多样性进行了分析.结果显示,三角帆蚌群体内的相似度为0.2917,褶纹冠蚌的为0.3636;两者的群体间相似系数为0.6723,遗传距离为0.3277.EST和LDH同工酶在褶纹冠蚌外套膜及内脏团组织中的表达酶谱均比在三角帆蚌中复杂,2种组织相比则内脏团中的表达酶谱比外套膜复杂.三角帆蚌和褶纹冠蚌同作为亲缘关系比较接近的主要育珠蚌种,两者各有优缺点.在珍珠养殖和育种上,一方面要重视野生资源的保护,避免近亲繁殖;另一方面要建立种质资源库,不断筛选出更多更好的优良性状,提高育珠的质量和产量.     

褶纹冠蚌优质珍珠的培育

褶纹冠蚌优质珍珠的培育众所周知，优质珍珠大多产于三角帆蚌．但三角帆蚌生长较慢、货源少，易发病并不易控制，故三角帆蚌育珠风险较大。褶纹冠蚌生长快，抗病力强．只要采取一定的措施，同样也能生产出优质珍珠．主要有以下措施：褶纹冠蚌以１—２龄时期生长最旺盛，之...     

提高二足龄三角帆蚌优质珠比例的试验

近几年来的生产实践说明，用褶纹冠蚌育出的珍珠珠质，不如用三角帆蚌育出的珍珠珠质，这不仅直接影响到国家创汇和集体经济的收入，甚至会影响到珍珠养殖业发展的方向。为此，我们开展了三角帆蚌育珠的研究，期望通过改革养殖工艺，改善管理办法，提高二足龄三角帆蚌优质珠的比例和成活率。     

三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验，差异表达基因均被富集了 2¹⁰倍左右，证明构建的 cDNA 消减文库具有很强的消减效率。PCR 鉴定发现，在随机挑取的阳性克隆中，95% 的克隆均含有 0.2～1.0 kb 的插入片段，这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得 214 个有效 cDNA 序列，分别属于8 大类，共 98 个基因。其中细胞分裂基因 2个、细胞结构与运动基因 9 个、代谢基因 10 个、信号传导基因 7 个、细胞防疫基因 10 个、基因与蛋白表达基因 20 个、未知功能蛋白基因 26 个，GenBank中找不到任何同源序列的基因 14 个。结果说明，构建的差异表达cDNA文库，可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。     

中国五大湖三角帆蚌群体遗传多样性及亲缘关系的SSR分析

采用微卫星技术，将9对微卫星引物用于我国五大淡水湖三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）群体，即鄱阳湖（PY）、洞庭湖（DT）、太湖（TH）、巢湖（CH）、洪泽湖（HZ ）群体的遗传多样性及亲缘关系的研究。数据经TFPGA软件估算，分别完成不同群体位点的杂合度值、群体间遗传距离和相似指数计算及聚类分析，确立了5个群体间的亲缘关系。研究结果表明：（1）三角帆蚌5个群体的平均表观杂合度0.4964～0.5621，期望杂合度0.5540～0.6270，多态信息含量0.4061～0.4665，其中鄱阳湖群体遗传多样性最高，而洪泽湖群体最低。（2）五个群体遗传相似度在0.8947以上，遗传距离在0.0267～0.1113。聚类分析结果显示，鄱阳湖、巢湖与太湖聚在一起，亲缘关系较近，而洞庭湖群体与洪泽湖群体亲缘关系较近。（3）鄱阳湖三角帆蚌种质最好，并具有很好的育种潜力。     

斑节对虾养殖群体遗传多样性的同工酶和RAPD分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和RAPD方法对厦门养殖斑节对虾（Penaeus monodon Fabricius）群体的遗传多样性进行分析。9种同工酶共检测到21个座位，其中多态座位13个，多态座位比例为61．90％，预期杂合度0．151，观察杂合度0．120，Hardy—Weinberg遗传偏离指数（d）为-0．208，存在杂合子缺失。经x^2拟合度检验，多数座位偏离Hardy—Weinberg平衡，表明群体未达到随机交配。14个10bp引物共获得了83个标记，单个引物获得的标记数为2～11个，平均每个引物扩增出5．93个座位，其中多态标记数68个，多态位点比例为81．93％，杂合度为0．246，基因多样性为0．260，Shannon’S信息指数为0．397。两种方法均表明该斑节对虾养殖群体的遗传多样性水平较高，但可能已有近交衰退发生。     

琼枝野生群体与养殖群体的EST-SSR分析

为研究野生琼枝与养殖琼枝的遗传差异,利用EST-SSR技术分析了海南东北部地区9株野生和9株养殖琼枝的遗传差异性。结果显示,用5对EST-SSR引物对18个个体的基因组进行扩增,扩增出的片段大小为250～2 500 bp,琼枝野生群体和养殖群体的多态性比例分别为74.29%和70.00%;野生群体之间的平均遗传距离为0.46,养殖琼枝群体之间的平均遗传距离为0.22。聚类分析图显示,在相似系数0.49处,18株群体按野生与养殖分为2大类,在相似系数0.66附近,野生群体分成3类,养殖琼枝群体分为2类,在相似系数0.73附近,野生琼枝群体分成5类,而养殖群体为3类,相似系数越高,野生群体比养殖群体分类单元越多。研究表明,野生琼枝群体的遗传多样性比养殖琼枝群体高。     

珍珠蚌5个群体不同阶段生长性能及外部形态变异分析

采用温室大棚早繁技术,获得三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)选育群体、武义养殖群体、鄱阳湖、洞庭湖野生群体,池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)养殖群体的子代,对1龄和2龄蚌的生长性能进行分析,并利用三种多元统计分析方法对1龄蚌外部形态变异进行了研究。结果显示:珍珠蚌5个群体的养殖性能由高到低为:池蝶蚌群体选育群体鄱阳湖群体洞庭湖群体养殖群体。生长指标之间存在显著相关性,与体质量相关程度由大到小为:壳长、壳宽和壳高。1龄时,影响珍珠蚌体质量的生长指标主要为壳长,2龄时,为壳长和壳宽。珍珠蚌生长后期壳宽对体重的影响比重加大,壳高与体重的相关性降低。三种多元分析结果显示,1龄时,池蝶蚌群体与鄱阳湖群体、洞庭湖群体以及养殖群体的外部形态存在较大的相似性,综合判别率较低,选育群体外部形态较前四者存在明显差异。     

三角帆蚌不同组织基因组DNA提取效果比较

利用平衡酚-氯仿法分别提取三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)斧足、鳃、闭壳肌、性腺、肝脏、心脏中的基因组DNA,采用紫外分光光度测定法、琼脂糖凝胶电泳法、PCR扩增法分析三角帆蚌不同组织基因组DNA的提取质量。结果表明,三角帆蚌6个组织均能成功地提取基因组DNA,但提取的DNA质量存在差异;斧足中提取的DNA纯度、浓度最高,PCR扩增的条带最亮,因而是三角帆蚌提取DNA的最佳组织;其次是肝脏和闭壳肌,心脏和性腺提取的DNA较差。     

小片与蚌间的关系对珍珠质量的影响

本研究采用褶纹冠蚌同一个体自体外套膜小片育珠,结果珍珠质量明显提高。采用三角帆蚌制取外套膜小片植入褶纹冠蚌。结果珍珠质量极差,大多数蚌产不出珍珠;采用褶纹冠蚌制取外套膜小片植入三角帆蚌,结果三分之一的蚌能得到质量高于褶纹冠蚌,产量高于三角帆蚌的珍珠。作者认为供片蚌和受片蚌间相适关系影响珍珠质量,研究如何提高褶纹冠蚌小片在三角帆蚌体内成珠的比率,在生产上是很有意义的。     

体外培养三角帆蚌外套膜细胞的生物学特性及有核珍珠培育

通过光学显微镜、透射电镜、流式细胞仪等方法对体外培养的三角帆蚌(Hyriopsis cumingiiLea)外套膜细胞进行观察和检测,证明其具有与蚌体内细胞相同的生物学结构、分裂增殖能力和分泌珍珠质的生物活性。在此基础上,对三角帆蚌有核珍珠培育技术进行探讨。将培养细胞黏附在表面经过促黏壁物质处理的珠核表面,再插入育珠蚌体内培育,120 d后,蚌体内可形成完备的珍珠囊,并在珠核表面有明显的珍珠质沉积;6个月后,珍珠质可将整个珠核包裹起来形成有核珍珠。本研究初步证明了细胞法培育有核珍珠的可行性。[中国水产科学,2007,14(1):149-154]