嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。     

罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1 335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性.应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5.     

嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板，根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物，扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段，定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中，重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明，插入片段长度为948bp，与NCBI上登录的几个相关序列相比，同源性在93．1％-95％之间，缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3），经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白，凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot，在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清，ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示，该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应，说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性，而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学，2008，15（2）：301—306]     

鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析

为筛选潜在的保护性抗原基因研制鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)基因工程疫苗,实验利用特异性引物扩增分离自斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的Y.ruckeri外膜蛋白omp F基因并对其进行分子克隆,应用相关软件和程序对其核苷酸及氨基酸序列进行生物信息学分析,并进行了omp F蛋白的表达和免疫原性检测。结果显示,omp F基因全长1 095 bp(Gen Bank登录号KP159420),包含一个编码364个氨基酸的完整开放阅读框,其氨基酸序列具有极高保守性,与Y.ruckeri外膜穿孔蛋白omp F(Gen Bank登录号ADK27779.1)亲缘关系最近,序列一致性为99.2%,进化树聚为一支;具有1个革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,存在1个信号肽和1个跨膜区,是一种跨膜蛋白;具有12个与免疫相关的抗原决定簇区域。SDS-PAGE分析发现该蛋白主要以包涵体形式表达在沉淀,经Western-bolt显示omp F蛋白具有较好的免疫原性。以上结果表明omp F基因可作为Y.ruckeri基因工程疫苗的候选抗原基因。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究

为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(omp A)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据Gen Bank上嗜水气单胞菌外膜蛋白omp A基因序列(Gen Bank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1 000 bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒p ET-32a(+)-pomp A;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pomp A重组蛋白;最后将pomp Aomp A蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾,评价其免疫效果。结果显示:克隆的嗜水气单胞菌pomp A基因全长为960 bp,编码319个氨基酸,融合表达的重组蛋白相对分子质量约为53,670 k Da;FIA能够提高斑点叉尾的溶菌酶活性、ACH50活性、头肾巨噬细胞呼吸暴发活性;pomp A组抗体水平在第4周达到峰值,FIA免疫组抗体水平在第5周达到峰值,且FIA能够显著提高斑点叉尾的抗体水平;攻毒后各组累计死亡率分别为93.33%(PBS)、93.33%(FIA)、50.00%(pomp A)和13.33%(FIA+pomp A),pomp A和FIA+pomp A组相对保护率分别为46.43%和85.71%;免疫组靶器官中的细菌数量显著低于对照组,且FIA+pomp A细菌含量最低。说明pomp A可以作为一个亚单位疫苗候选疫苗,而FIA佐剂能较好的增强亚单位疫苗的免疫效果。     

luxR基因调控嗜水气单胞菌耐药性的分子机制初探

LuxR家族蛋白是一类在革兰氏阴性细菌中发挥重要作用的调控蛋白，参与细菌多项重要生理活动。采用RNAi技术构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) luxR05735稳定沉默菌株luxR05735-RNAi，并利用qRT-PCR检测基因沉默效果。结果显示，与野生株相比，沉默株中luxR05735的表达量降低了96.8%。药物敏感性实验表明，与野生株相比，luxR05735-RNAi对庆大霉素、诺氟沙星、卡那霉素、吡哌酸的耐药性显著降低。对野生株与沉默株luxR05735-RNAi的转录组数据进行分析发现，表达差异显著的基因共有1286个，其中，上调基因353个，下调基因933个；显著富集的通路4条，分别是核糖体通路、精氨酸生物合成通路、硫代谢通路、硒化合物代谢通路；在这4条通路中可能与嗜水气单胞菌耐药性相关的重要功能基因包括metE、glnA、rplB、rplX、rpsA、rpsJ等，这些功能基因编码的蛋白主要与细菌的生物成膜及核糖体蛋白合成相关。综合以上研究结果，可以推测嗜水气单胞菌的luxR05735通过调控细菌的生物膜形成相关基因及核糖体蛋白相关基因的表达，从而调控细菌对药物的耐受性。     

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测;将代表菌株的外膜蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和1株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析。结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100%;所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0%～99.2%之间。所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3%～100%,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100%。     

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

一株引起香鱼出血症的嗜水气单胞菌的鉴定

从发生出血症的香鱼体腔液分离到一高致病性的菌株(ayu-ah0201),经人工侵染试验证实该菌能引起香鱼出血症.对该菌的形态、生理生化及16S rDNA序列分析结果表明,其为革兰氏阴性,短杆状,极生鞭毛.对蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶呈阳性,鸟氨酸脱羧酶呈阴性.可利用葡萄糖产酸产气.在以该菌16S rDNA序列和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列构建的系统发育树,表明分离菌ayu-ah0201与嗜水气单胞菌聚在一簇,与嗜水气单胞菌核苷酸序列同源性最高,为99.6%～99.7%,与其他相关气单胞菌属成员的核苷酸序列同源性小于98.9%.结合形态和生理生化特点将其鉴定为嗜水气单胞菌.     

鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达

A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene (omp) of Aeromonas hydrophila . With the specific primers, a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR .The target fragment was inserted into the linearized pGEM-T easy vector. After enzyme restriction and sequencing analysis,the nucleotide data had been further analyzed by DNAman and ClutalW software. The analysis results showed that the cloned DNA fragment had a longest open reading frame (ORF) of 1035 nt,it predicted to be encoded a 344 aa protein with the molecular weight of 36 kD. Hydrophobicity analysis suggested that the protein was highly hydrophilic, especialy at the first 24 aminoacid, this region could function as signal peptide. The homologious comparison proved the cloned gene had 96% homology to the sequence of the omp gene, and the alignment of the amino acid sequence was 98% . The recombinant plasmid was constructed with the target gene and the expressing vector pGEX-4T-1 and then was transformed into E. coli BL21（DE3）by BamH and Sal I .The fusion protein was expressed under the IPTG inducing condition,and exhibited about 62 kD in size,very close to the predicted molecular weight of GSTMOMP, furthermore,the fusion protein was specifically recognized by antiserum which raised against the major outer membrane protein of AHML316. Considering all these together, it proved that the cloned gene represented the major outer membrane protein gene of AHML316, and the expressed gene products shared identical antigenicity with the natural main outer membrane protein,and also provided technical support for developing an advanced gene engineering vaccine against Aeromonas hydrophila.     

Cloning and characterization of the haemolysin determinants from Aeromonas hydrophila

Abstract. Two haemolysin genes (AHH4 and AHH-2) of Aeromonas hydrophila ATCC7966 were cloned into a plasmid vector in Escherichia coli K-12. An open reading frame (ORF) of the AHH-1 haemolysin gene was 1734 base pairs (bp). and corresponded to a protein of 577 amino acid residues. Analysis of the deduced amino sequence indicated a highly hydrophobic N-terminal region which had the characteristics of a leader peptide. The sequence also included the -10 region and the -35 region of a promoter, and a ribosome- binding site upstream from the ORF. The termination site was located downstream from the ORF. The haemolysin was a thermolabile protein with the predicted molecular mass of 60 kDa. The AHH-1 gene is distributed in various A. hydrophila and A. salmonicida strains. The nucleotide sequence of a 981 bp ORF of the AHH-2 gene was encoded with the predicted molecular mass of 377 kDa polypeptides. The homology of the nucleotide sequence was very low between the AHH-1 and AHH-2 genes, and also with the aerolysin gene cloned by Howard & Buckley (19S6). No leader peptide was found in the N-terminal region of the ORF of the AHH2 gene. The AHH-2 gene was detected in the original strain ATCC7966, but was not detected in other tested strains of A. hydrophila and A. salmonicida.     

草鱼胰岛素样生长因子_基因克隆及序列分析

采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从草鱼肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因序列,定向克隆至质粒pUC18,测宇了该基因序列,推导期编码的蛋白序列,克隆的cDNA序列编码包括Ｂ,Ｃ,Ａ,Ｄ和Ｅ五个区域的１７个氨基酸,与鲤ＩＧＦ－Ｉ成熟肽比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为９３．８％和９７．１％,E区域分析结果表明,所克隆的草鱼ＩＧＦ－Ｉ序列属于ＩＧＦ－ＩＥa-2亚型。     

罗氏沼虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因的克隆及分析

根据已公布的罗氏沼虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因序列设计一对特异性引物,从疑似患白斑病毒病的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增、克隆并测序后将该片段通过GenBank比对,证实为WSSV的VP28基因;与20个已公布的WSSV VP28进行同源性比较,结果显示:从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类,印度对虾WSSV VP28为另一类,罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类。根据测序结果推测VP28蛋白的二级结构在氨基酸的7～29区间可能为跨膜螺旋区,且该区域高度保守。     

草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7基因真核表达载体pCI-VP7的构建及鉴定

将编码草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)主要衣壳蛋白VP70.9kb的基因片段连接至克隆载体pMD19-T中,筛选阳性克隆并测序,经检测为正确序列后,再将目的片段克隆入真核表达载体pCI,筛选得到阳性重组质粒pCI-VP7。然后构建pCI-VP-GFP重组表达质粒(即GFP基因与VP7的一段上游基因融合表达),用PCR及酶切方法鉴定克隆的正确性。并用脂质体法将其转染入真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及RT-PCR特异性检测。结果表明,GFP基因与VP7的一段上游基因被成功转染到COS-1和CIK细胞,并得到了很好的表达。进而证明pCI-VP7可以成功的表达,为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。     

三疣梭子蟹Sox基因HMG盒的克隆分析

利用能扩增人类SRY基因HMG盒的一对简并引物,分别对三疣梭子蟹雌雄个体基因组DNA进行扩增,均得到216 bp和约400 bp的两条带,不存在性别差异,通过PCR-SSCP分析,未发现雌蟹或雄蟹所特有的Sox基因。对216 bp的带进行克隆测序得到6个Sox基因,分别命名为PTSox21、PTSox12、PTSox11a、PTSox11b、PTSox11c和PTSox4。其中,PTSox21、PTSox12和PTSox4氨基酸序列与人类Sox21、Sox12和Sox4基因的同源性分别为90%、66%和63%,PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c氨基酸序列均与人类Sox11基因有63%的同源性。此外,PTSox11a和PTSox11b的氨基酸序列之间的同源性达到了98.6%,只在第44位氨基酸残基不同。与其他物种Sox基因氨基酸序列的同源性比较发现,PTSox21与饰纹姬蛙Sox2a有92%的同源性,而PTSox12、PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c均与意大利蜜蜂的Sox1有73%的同源性,PTSox4与意大利蜜蜂的Sox1有72%的同源性。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

Cloning, characterization, and insertional inactivation of a major extracellular serine protease gene with elastolytic activity from Aeromonas hydrophila

The gene ahpA from Aeromonas hydrophila AG2 encoding an extracellular serine protease, named AhpA, was cloned in pUC18 plasmid. Nucleotide sequence analysis revealed an open reading frame of 1875 bp encoding a 625 amino-acid protein with a molecular weight of 67 567 Da. The gene ahpA was efficiently expressed in Escherichia coli C600 and in the non-proteolytic A. salmonicida masoucida , which was able to overproduce the 64-kDa protease found in the culture supernatant. The N-terminal amino acid sequence of the purified protein revealed a perfect match with the deduced DNA sequence starting at AAT (Asn-25), indicating that AhpA is synthesized as a pre-enzyme with a 24-amino-acid signal peptide and a 601-amino-acid mature extracellular protease. Purified protease had an optimum pH of 7.5 and its activity was strongly inhibited by PMSF, a serine protease inhibitor. The protease hydrolysed casein and elastin. The amino acid sequence of AhpA was highly homologous to A. salmonicida serine protease AspA. Inoculation of A. hydrophila ahpA mutant into trout suggests that the major AhpA secreted protease is not essential for virulence.