香鱼优质受精卵和发眼卵的大量获取技术

分别从提高香鱼受精率和发眼率两方面介绍了香鱼优质受精卵和发眼卵的大量获取技术，以期为香鱼养殖提供参考。     

酵母双杂交系统在植物病毒学中的应用

酵母双杂交系统应用有效的酵母遗传学方法分析蛋白质问相互作用,已成为鉴定蛋白质相互作用强有力的方法之一。文章从植物病毒编码的蛋白质间、植物病毒蛋白与植物蛋白间、植物病毒蛋白与介体蛋白间等3个方面阐述了酵母双杂交系统在植物病毒学中的应用现状,并对其应用前景进行了展望。     

香鱼肝胰腺cDNA文库的构建和鉴定

以香鱼正常肝胰腺为材料,构建cDNA文库。初始文库库容大于1.3×107cfu/ml,扩增文库的滴度大于1.1×106cfu/ml,平均插入片段约为1.0 kb。从文库中随机挑选297个cDNA克隆测序,得到232个功能已知EST序列,功能包括代谢、蛋白质合成、细胞与机体防御、信号转导以及细胞结构与运动等5个方面。随机测序获得香鱼弹性蛋白酶(Elastase,ELA)编码序列,cDNA序列全长957个核苷酸,3’-末端具有polyA尾,编码一个由268个氨基酸组成28.7 ku大小蛋白。序列分析表明,香鱼ELA的N端15个氨基酸为信号肽,成熟肽具有丝氨酸蛋白酶家族的典型结构特征。香鱼ELA与斜带石斑鱼、大西洋鳕和金头鲷的ELA氨基酸序列同源性最高,达76%~77%。系统进化树分析表明,香鱼ELA与其他鱼类ELA紧密成簇。RT-PCR检测显示,香鱼ELA基因mRNA在香鱼肝胰腺、脾、肠组织中均大量表达。     

环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测鳗利斯顿氏菌的研究

采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD),建立一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法。针对鳗利斯顿氏菌金属蛋白酶基因设计一套特异性引物及异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,结合生物素标记的环介导等温扩增技术扩增反应和横向流动试纸条技术对鳗利斯顿氏菌进行检测;比较LAMP-AGE、LAMP-LFD和PCR-AGE的灵敏度;选取4株鳗利斯顿氏菌和6株非鳗利斯顿氏菌验证LAMP-LFD特异性。试验结果表明,应用LAMP-LFD,能在30 min内完成鳗利斯顿氏菌的检测;LAMP-LFD检测的灵敏度为7.7 cfu/ml,LAMP-AGE和PCR-AGE检测的灵敏度均为77 cfu/ml;4株鳗利斯顿氏菌均呈阳性反应,其他6株非鳗利斯顿氏菌均为阴性。应用LAMP-LFD检测鳗利斯顿氏菌特异性强、灵敏度高、并且操作安全、简便、快捷。     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

香鱼Wap65-2在昆虫杆状病毒系统中的表达及其与补体C3的相互作用验证

Wap65-2 (Warm temperature acclimation related 65 kD protein-2)是至今仅在鱼类中发现的糖蛋白,与鱼类温度、细菌感染、重金属等胁迫等紧密相关。近年来其在鱼类抗细菌免疫反应中的作用引起广泛关注。本研究主要利用昆虫细胞杆状病毒载体系统(baculovirus expression vector system, BEVS)表达重组香鱼(Plecoglossus altivelis) Wap65-2成熟肽(recombinant ayu mature Wap65-2, rPaWap65-2m),建立真核生物表达具有生物活性rPaWap65-2m的制备方法。首先克隆获得香鱼Wap65-2基因的重组杆粒,将重组杆粒转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞(Sf9)获得病毒储液,用高滴度P3代病毒储液继续感染Sf9细胞,Western blot技术检测培养基中的重组蛋白。在最佳条件下无血清悬浮扩大培养,收集培养基上清,再经阴离子交换层析柱和镍亲和层析柱纯化获得rPaWap65-2m。采用His-tag pulldown技术验证rPaWap65-2m与血清补体C3 (complement 3)蛋白之间的相互作用。结果表明,P3代病毒储液感染Sf9细胞后,Western blot结果表明r PaWap65-2m以非N-连接糖基化形式表达并分泌至培养基上清。感染复数(multiplicity of infection, MOI)为5且感染72 h后,重组蛋白表达条件最佳。经纯化的rPaWap65-2m纯度大于93%,可用于后续实验。pulldown实验显示rPaWap65-2m蛋白与C3蛋白相互作用。综上,本研究获得了具有生物活性的rPaWap65-2m蛋白,并验证了r PaWap65-2m蛋白与血清中补体C3的相互作用,为后续免疫相关功能研究奠定了基础。     

超分支滚环扩增法检测传染性脾肾坏死病毒

用超分支滚环扩增法检出传染性脾肾坏死病毒。超分支滚环扩增法包括锁式探针的连接及超分支滚环扩增法扩增两部分,通过研究锁式探针的最佳连接体系和连接条件,并进行超分支滚环扩增法反应条件的优化,得出的本研究最适反应条件为:锁式探针在T4 DNA连接酶作用下37℃连接20 min,接下来的超分支滚环扩增法在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应40 min,即能够实现靶序列的有效检出。灵敏度试验表明,超分支滚环扩增法所能检测到的最低模板量接近1 copy。在4种病毒中进行的特异性试验表明,本方法能够保证对传染性脾肾坏死病的特异性检测。     

薤花叶病毒外壳蛋白抗血清制备及其与相关病毒血清学关系

为研究薤花叶病毒（Scallion mosaic virus，ScaMV）与其它一些马铃薯Y病毒属成员之间的血清学关系，先构建原核表达载体pSB-ScaMV-CP，然后确定该质粒能在大肠杆菌BL21 plys S过量表达目的蛋白，最后用两次制备SDS-PAGE电泳分离纯化的CP免疫小鼠，获得的抗血清效价为1：1024。Western blot分析表明，ScaMV CP抗血清能与病毒自身CP有较强的特异性反应，与芜菁花叶病毒（TuMV）、水仙黄条病毒（NYSV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）和芋花叶病毒（DsMV）CP有较弱的反应，与其它15种马铃薯Y病毒属病毒CP无反应。     

我国49种线状植物病毒分子鉴定及其基因组研究

本研究建立了马铃薯Y病毒属、马铃薯X病毒属、麝香石竹潜隐病毒属和葱X病毒属成员RT-PCR检测和全基因组扩增技术体系,并成功用于60多种供试植物病毒的检测诊断。利用所建立的技术体系,从全国18个省市42种作物上采集的病样中鉴定了49种植物病毒,其中10种为新种,11种为国内新记录,更正了7种病毒的鉴定和命名。测定了这49种病毒217个分离物基因组序列,并全部在国际基因数据库登录,占全球登录的植物病毒基因组序列总数的3.8%,其中27种植物病毒为基因组全序列,20种为国际首次报道,15种病毒全序列被美国国家生物技术信息中心(NCBI)确定为相关病毒的标准序列。     

大黄鱼热激蛋白cDNA克隆及系统发育分析

根据已报道的HSP基因序列（EMB登录号：AF506290），设计出特异引物，PCR扩增后测序，获得1．7kh大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体，高等动物编码的HSP在进化上紧密相关，形成一个显著群体，大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中，这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合，其中与非洲爪蟾的同源性最高（92．3％），也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析，可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础，同时对大黄鱼的品质改良和良种的选育有重要意义。