史氏鲟精子超低温冷冻保存研究

比较了史氏鲟精子在3种不同配比浓度稀释液的保存效果。试验结果表明,配方Ⅲ作为稀释液,8%甲醇作为抗冻剂,二步法超低温(-196℃)冷冻保存,5h后取出,38℃水浴解冻取得最好的冻后激活率,解冻后激活率为(52.3±3.5)%。解冻精子分别采用井水和激活液D(10mmol/L Tris+10mmol/L NaCl+25mmol/L Glu,pH 8.0)激活,进行人工授精。结果显示配方Ⅲ冻精采用激活液D激活授精获得最高受精率为68.56%,最高孵化率为52.91%。本次试验表明,1～2mmol/L范围内,低浓度K+比高浓度K+对史氏鲟精子保存有利;52～82mosmol/kg范围内,高渗稀释液有利于史氏鲟精子的保存;且激活授精方法是影响冻精受精率和孵化率的关键因素之一。     

瓦氏黄颡鱼精子的生理特性及其超低温冷冻保存的初步研究

对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)精子在不同盐度和pH下的精子活力进行观察,同时研究了精子在4种不同稀释液与2种不同浓度抗冻剂组成的保存液中的超低温冷冻保存,并开展了冻精的授精实验。结果表明,瓦氏黄颡鱼精子浓度为(2.035±0.179)×1012cell·mL-1,在盐度为5.8、pH为7.17时,精子的活力都高达95%。以A液作为稀释液、10%甲醇作为抗冻剂时,冷冻保存精子效果最好,解冻后精子活力为(81.7±0.9)%。用解冻后的精子进行人工授精,获得的受精率为(88.4±2.1)%,孵化率为(74.0±0.8)%;而鲜精受精率为(91.0±0.8)%,孵化率(82±1.6)%,冻精与鲜精均无显著性差异。人工授精实验证明了解冻后的精子能正常用于该鱼的人工繁殖。     

超低温冻存时间对史氏鲟精子活力的影响

为研究超低温冻存时间对史氏鲟精子活力的影响,使用史氏鲟冻精与鳇鱼卵子进行了杂交授精试验。结果显示:经超低温冷冻后的精液,与对照组的鲜精(126.7±9.4 s)比较,其寿命显著下降(冻存5 h的为78.7±4.11 s,336 d的为72.0±4.32 s,702 d的为57.3±2.05 s),且授精率和受精卵的孵化率受到显著影响。冻存5 h的精液,其授精率和受精卵孵化率分别为(73.31±15.27)%和(55.68±9.81)%,与鲜精比较差异不显著(P>0.05),而冻存时间为336 d[授精率(59.20±2.39)%,受精卵孵化率(53.08±1.23)%]和702 d[授精率(25.29±8.26)%,受精卵孵化率(21.38±9.91)%]的精液则差异显著。结果表明,超低温冷冻对史氏鲟精子造成了一定程度的损伤,长时间的超低温冻存会显著降低精子的活力,影响授精率和受精卵的孵化率。     

人工养殖西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存研究

研究了人工养殖西伯利亚鲟精子的生物学特征及超低温冷冻保存方法。西伯利亚鲟的产精量为113.67±39.86 ml,精子密度为(6.49±3.10)×108/ml,精子活力为(85.4±9.5)%,精子寿命为353±23 s。精子密度与精子快速运动时间、精子寿命之间均存在线性相关,用方程分别表示为:y=1.0384x+1.5089(R2=0.7325);y=2.9069x+74.289(R2=0.6967)。结果表明精子密度可作为一项精子质量评价的标准。通过比较西伯利亚鲟精子在不同稀释液、不同抗冻剂和抗冻剂浓度、降温速率、解冻温度下的保存效果,结果表明:配方2作为稀释液,18%甲醇作为抗冻剂,二步法超低温(-196℃)冷冻保存精子,40℃水浴解冻取得最好的冻后活力,解冻后活力为(51.8±5.8)%。西伯利亚鲟授精的最佳精卵比为106∶1。在此精卵比下用冻精授精分别得到了(72.3±3)%的受精率和(52.9±4.1)%的孵化率,其中受精率与鲜精没有显著性差异,孵化率与鲜精有显著差异(P<0.05)。     

家鱼冷冻精液激活、授精方法的研究

激活—授精溶液渗透压对家鱼冻精的能育性有明显影响。当用1毫升冻精与4 毫升卵子授精时,冻精与鲜卵在水中与在 171和 342 mOsm/l NaCl 溶液中的受精率均很高(91％左右),无明显差别;当精卵量比为 1:16时,在水中的受精率明显低于在上述 NaCl 溶液中的受精率;当精卵量比升高到 1:32以上时,冻精在 174mOsm/l 溶液中的受精率明显高于其它二组。鲢卵在171和342 mOsm/l 溶液中维持受精能力的有效时间(6 分钟)明显长于在淡水中(2 分钟)。当精子稀释难的 pH 值偏碱(8.7)和冻精激活—授精溶液偏酸(pH6.3)时,冻精的受精率明显下降。解冻后精子在 4℃存放1.5小时活力和受精率下降不多,少数冻精可存活长达 16小时。冻精活力与受精率之间存在着明显正相关,相关系数为0.97,回归方程为 Y=3.68 1.23X。     

细鳞鲑、哲罗鲑两种授精方法效果的比较

细鳞鲑(Brachymystax lenok)、哲罗鲑(Hucho taimen)在人工繁殖过程中常用两种授精方法,即干法授精和湿法授精。为找到哪种授精方法更有效,受精率更高,更有利于生产,对两种授精方法进行了对比试验。结果表明:在同等条件下细鳞鲑、哲罗鲑干法授精较湿法授精效果好,受精率分别提高9.63%和4.46%。     

石鲽、牙鲆精子冷冻保存研究及其在人工杂交中的应用

对石鲽(Kareius bicoloratus )和牙鲆(Paralichthys olivaceus)精子冷冻保存技术进行了研究,筛选到一个优良的稀释液MPRS,用MPRS冷冻保存石鲽、牙鲆精子,冻后成活率在70%以上。在石鲽冻精和牙鲆卵的杂交实验中,杂交组受精率是 28 4%±4 55(n=3),孵化率是 42 7%±7 35(n=3),胚胎发育正常;5 000尾杂交鱼苗有102尾成功度过变态期。在牙鲆冻精和大菱鲆卵的杂交实验中,杂交组的受精率只有2 7%,部分受精卵虽能孵化出膜,但仔鱼全为畸形。这两个杂交实验,特别是石鲽冻精和牙鲆卵的杂交实验,证实了冷冻保存的精子完全可以应用在杂交育种工作中。     

棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存研究

为保护和利用棘头梅童鱼种质资源,以常用无机盐及葡萄糖配制的5种溶液(依次编号A、B、C、D、E)作为稀释液,不同体积分数的DMSO作为抗冻剂,采用2 mL冻存管和两步降温的方式,对棘头梅童鱼精子的超低温冷冻保存技术进行了研究,并利用人工养殖黄姑鱼的成熟卵子对冻存3年的棘头梅童鱼冷冻精子的授精能力进行检验。结果表明,以E溶液为稀释液、10%DMSO为抗冻剂、两步降温方式冷冻保存的棘头梅童鱼精子在37℃水浴解冻后复活率较高,为(76.67±10.41)%^82.33±4.62%;以上述方法冻存3年的棘头梅童鱼冷冻精子与人工养殖黄姑鱼的成熟卵子杂交,受精率达到(20.26±4.12)%。     

半滑舌鳎精子冷冻保存

半滑舌鳎精子冷冻保存对于人工繁殖育苗、杂交育种、雌核发育及其性别控制研究具有重要的意义，为此，本文对半滑舌鳎精子冷冻保存方法进行了研究。分别利用2．8mol／L的二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）和1，2-丙二醇（PG）冷冻保存该鱼精子。结果显示，DMSO冷冻保存精子的活力较高。利用MPRS＋2．8mol／L DMSO以1：0．5、1：1、1：1．5和1：2的比例稀释并冷冻精子，1：1比例在冻前能够抑制精子的运动，冻后活力可达82．50±3．54％，显著高于其他稀释比例（P〈0．05）。分别利用冷冻保存液A（MPRS＋2．8mol／L DMSO）和B（TS-2＋2．8mol／LDMSO）稀释平衡精子，精子在A中的冻前快速运动时间、寿命分别为37．75±6．45S和145．00±78．98S，与鲜精无显著差异（P〉0．05）。利用以上两种冷冻稀释液冷冻保存精子,精子在A液中的冻后活力和寿命分别可达53．50±6．69％和98．00±13．51s，冷冻效果优于B液（P〈0．05）。冷冻后精子的受精率和孵化率分别为55．00±5．00％和35．00±13．23％，受精率与鲜精无显著性差异（P〉0．05），因此认为MPRS＋2．8mol／L DMSO可用于半滑舌鳎精子的冷冻保存。     

单环刺螠的人工苗种生产研究Ⅰ.环境因子对单环刺螠受精与孵化的影响

为对单环刺螠(Urechis unicinctus)的人工苗种生产提供科学有效的基础资料,进行了受精方式和环境因子对单环刺螠受精与孵化的影响研究。结果表明,自然受精的受精率(95.67±2.32)%显著高于人工授精(8.79±6.02)%~(57.83±8.23)%(P0.05);人工授精中,精卵比例为5∶1~10∶1时的受精率显著高于其他人工授精组实验组(P0.05),可达50%左右。环境因子中,水温在15.0~21.0℃时,孵化率均达86%以上,显著高于其他水温组(P0.05);盐度为24.1~30.0的实验组中有幼虫孵化,且盐度为27.2时孵化率最高,为(86.70±2.24)%,与其他盐度组差异均显著(P0.05);pH为6.96~9.01的实验组中有幼虫孵化,且pH为8.02时孵化率最高,为(84.26±4.20)%,与其他pH组差异均显著(P0.05);受精卵密度为1 ind./mL时的孵化率为(89.43±2.34)%,较其他实验组稍高,但差异不显著(P0.05);充气+搅动实验组的孵化率为(90.50±2.23)%,显著高于其他组(P0.05),通过搅动水体可将孵化率提高30%以上,而充气可将孵化率提高10%以上。综上所述,受精方式的不同以及环境因子(水温、盐度、pH、充气方式等)的变化会直接影响单环刺螠的受精率和孵化率。本研究通过对比实验,获得了单环刺螠人工授精的最佳精卵比例以及在较大实验水体中受精卵孵化的最适环境因子条件,这将为单环刺螠的全人工苗种繁育工作提供参考依据。     

云纹石斑鱼精子冷冻保存

以云纹石斑鱼精液为实验材料,对精子稀释液、抗冻剂种类和适宜浓度、冷冻保存液进行了筛选。结果表明,利用9g/L NaCl、10g/L KHCO3和10%小牛血清配制而成的稀释液EM1-2适宜于云纹石斑鱼精子冷冻保存,以2ml冷冻管为精子容器,在60L液氮生物保存罐中冷冻保存精子,冷冻解冻精子活力可达56.67%±5.77%,要优于TS-2、ES1-3和其他EM系列稀释液冷冻保存精子活力。利用EM1-2为基础液对抗冻保护剂进行筛选,结果显示,10%~20%的二甲基亚砜(DMSO)和1-2-丙二醇(PG)冷冻保存后精子活力无显著差异(P0.05),其中15%的DMSO和10%PG冷冻保存精子效果最优,解冻后精子活力分别可达54.52%±7.81%和57.24%±3.69%。利用冷冻保存1年的精液与云纹石斑鱼卵进行受精,受精率和孵化率均达到80%以上,与新鲜精子无显著性差异(P0.05)。本研究表明,利用EM1-2配制15%的DMSO或10%的PG可用于冷冻保存云纹石斑鱼精液。在此基础上,建立了精子冷冻库,保存精子130ml,为人工繁育和杂交育种提供了丰富的精子源。     

云纹石斑鱼精子冷冻保存

以云纹石斑鱼精液为实验材料,对精子稀释液、抗冻剂种类和适宜浓度、冷冻保存液进行了筛选。结果表明,利用9g/L NaCl、10g/L KHCO3和10%小牛血清配制而成的稀释液EM1-2适宜于云纹石斑鱼精子冷冻保存,以2ml冷冻管为精子容器,在60L液氮生物保存罐中冷冻保存精子,冷冻解冻精子活力可达56.67%±5.77%,要优于TS-2、ES1-3和其他EM系列稀释液冷冻保存精子活力。利用EM1-2为基础液对抗冻保护剂进行筛选,结果显示,10%~20%的二甲基亚砜(DMSO)和1-2-丙二醇(PG)冷冻保存后精子活力无显著差异(P0.05),其中15%的DMSO和10%PG冷冻保存精子效果最优,解冻后精子活力分别可达54.52%±7.81%和57.24%±3.69%。利用冷冻保存1年的精液与云纹石斑鱼卵进行受精,受精率和孵化率均达到80%以上,与新鲜精子无显著性差异(P0.05)。本研究表明,利用EM1-2配制15%的DMSO或10%的PG可用于冷冻保存云纹石斑鱼精液。在此基础上,建立了精子冷冻库,保存精子130ml,为人工繁育和杂交育种提供了丰富的精子源。     

圆口铜鱼精子超低温冷冻保存

为建立圆口铜鱼(Coreius guichenoti)精子超低温冷冻保存方法,采用计算机辅助精子分析系统(CASA)评价了4种稀释液(D15、D20、L1、D1), 3种抗冻保护剂[二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(METH)]在3种体积浓度(7.5%、10%、12.5%, V/V)下对圆口铜鱼精液的冷冻保存效果,并比较了150 mOsm/kg NaCl与超纯水作为激活剂对精子活力的影响。结果表明,D1组稀释液的精子活率(MOT)最高,为(74.64±13.17)%,与鲜精无显著差异(P0.05);以10%甲醇作为抗冻保护剂的圆口铜鱼精子经超纯水激活后,测得MOT最高,达到(78.11±14.74)%,与鲜精无显著差异(P0.05),精子运动速度达最大,平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)、VAP(平均路径运动速度)分别达到(50.28±12.46)μm/s、(35.06±10.82)μm/s、(39.44±12.46)μm/s,精子快速运动时间和寿命分别为(8.67±1.15) s、(33.33±5.00) s,显著低于鲜精(P0.05); 7.5%甲醇组和7.5%二甲基甲酰胺组的MOT次之,分别为(77.71±17.74)%、(76.42±12.49)%,抗冻剂二甲基亚砜组的MOT显著低于甲醇组、二甲基甲酰胺组(P0.05)。12.5%的3种抗冻保护剂中,几乎无精子存活;在不同种类不同浓度的抗冻剂保护下,10%甲醇组,相较于使用超纯水激活,用150 mOsm/kg NaCl激活后的精子活率和寿命更高,说明Na~+有延长冻精寿命,提高精子活率的作用。研究表明, D1+10%METH (7.8 g/L NaCl+0.5 g/L KCl+15 g/L葡萄糖+10%METH)可用于圆口铜鱼精液超低温冷冻保存,为圆口铜鱼的繁育工作和种质资源保护奠定了基础。     

舟山渔场银鲳人工授精及孵化

2005-2008年,在舟山海域银鲳(Pampus argenteus)繁殖季节(4-5月),随流刺网或张网捕鱼船出海,捕捞性腺成熟的银鲳,进行人工授精和孵化.人工授精试验采用干法、湿法和半干法,比较受精率和孵化率.通过4年连续测量银鲳成熟卵的卵径、油球径等形态指标,对卵子成熟度进行判别,在水温16.0～18.5 ℃、盐度28.0±0.5的条件下进行孵化.结果表明,以干法受精后间隔3～5 min水洗和半干法受精的方法受精率最高,受精率达18.50%～33.50%,最高达40%;孵化率达到43.83%～51.00%,最高达66%.银鲳成熟卵子的卵径为(1.368±0.082)mm,油球径为(0.550±0.031)mm,油球1个.对影响海捕银鲳亲体受精率和孵化率的环境条件也进行了讨论.     

不同蛋白质日粮对种鹅生产性能的影响

为了确定在种鹅生产期日粮蛋白质对种鹅的产蛋量、受精率和孵化率的影响,进行本试验。结果表明:(1)在本试验水平下,不同蛋白质水平日粮对种鹅产蛋量影响不显著;(2)在本实验水平下,不同蛋白质水平日粮对种蛋的受精率和孵化率影响显著。实验组和对照组的种蛋受精率相差30%以上;(3)不同蛋白质水平日粮对种蛋孵化率影响显著。     

低渗溶液浓度对黄颡鱼精子活力和受精率的影响

为提高黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)人工授精的稳定性,分别用卵子和精子同步激活法以及预激活精子法,在6个梯度浓度(0%～0.5%)范围的低渗溶液中进行人工授精试验,比较精子活力、受精率和孵化率。结果显示:低渗溶液浓度与精子活力、精子激活率和受精率密切相关,在相同浓度的低渗溶液组中采用预激活精子法的受精率显著高于卵子和精子同步激活法(P<0.05),受精率相对应提高了7.7%～14.5%;低渗溶液的浓度和人工授精方式对孵化率无显著影响。结果表明在浓度0.3%的低渗溶液中采用预激活精子法的效果最好。     

日本盘鲍精子激活剂的研究初探

选择NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4三种铵盐作日本盘鲍精子激活剂,在经氨水(NH3·H2O)调节pH值的条件下,进行鲍精子激活效果的试验研究,三种铵盐对鲍精子的激活效果依次为:NH4Cl＞NH4NO3＞(NH4)2SO1.最佳激活剂浓度范围为:NH4Cl、NH4NO3为0.25-0.4%;(NH4)2SO4为0.3-0.4%.pH值9.0-10.0时激活精子最佳,激活率达到75%以上,但受精率尤其孵化率适宜较低PH值,pH8.5-9.5受精率达到90%以上,pH8.2-9.0孵化率达到85%以上.     

中华鲟胚胎细胞的冷冻保存及其核移植

为了保存濒危鱼类中华鲟种质资源,对其囊胚细胞和原肠细胞进行了冷冻保存和核移植试验。用二甲亚砜(DMSO)、1,2-丙二醇(PG)、羟乙基淀粉(HES)3种抗冻剂,配制4种冷冻保护液:CP1(12%D)、CP2(10%P)、CP3(8%D 6%E)、CP4(7%P 6%E),冷冻细胞存活率分别为47.4%±4.7%、64.4%±3.6%、54.7%±4.7%、76.7%±5.7%,CP4保存效果最好,说明添加非渗透型抗冻剂羟乙基淀粉能提高冷冻保存细胞的存活率。比较了两种冷冻方法,发现细胞在-7℃平衡30min之后直接投入液氮的一步冷冻降温法是可行的。对不同发育时期的胚胎细胞冷冻存活率进行了比较,结果表明原肠细胞冷冻存活率(64.4%±11.8%)明显比囊胚细胞的(57.1%±11.2%)高(P<0.05)。用冷冻复苏后的囊胚细胞和原肠细胞作供体,以中华鲟未受精卵作受体进行核移植,各移植了469和392枚卵,分别获得了5尾和2尾克隆鱼,核移植成功率分别为1.1%和0.5%。表明可通过冷冻保存胚胎细胞结合核移植技术保存鱼类种质资源。     

胡子鲶不同孵化方法效果分析

通过不同孵化方法的繁殖试验,比较了胡子鲶3种孵化方法的受精、孵化效果以及孵出10 d后的鱼苗成活率。试验结果:A组(对照组,常规孵化桶孵化模式)平均受精率为85.7%,平均孵化率为74.1%,10 d后鱼苗平均成活率为88.11%;B组(薄膜氧气袋充氧孵化模式)平均受精率为93.4%,平均孵化率为90.3%,10 d后鱼苗平均成活率为88.98%;C组(薄膜氧气袋充氧,并放在泡沫箱内保温的孵化模式)平均受精率为95.0%,平均孵化率为92.1%,10 d后平均成活率为84.57%。结果表明,B、C组薄膜氧气袋的孵化效果好于A组,薄膜氧气袋孵化模式具有保温、节能、节水等作用,且生产上方便、可操作性强,有利于胡子鲶苗种的规模化繁殖。     

中华鲟全人工繁殖技术研究

中华鲟(Acipenser sinensis)在人工驯养条件下性腺发育并最终成熟是突破中华鲟全人工繁殖技术的关键环节,有效的养殖模式对促进中华鲟性腺发育成熟、提前成熟以及实现雌雄同步成熟具有非常重要的作用。本研究在不同养殖模式(水温和营养调控)下对中华鲟性腺发育状况进行长期观测。结果显示,中华鲟在仿自然变温或恒温的养殖环境中,性腺均可发育至III期。采用配合饲料、饲料中添加鲜活鱼或冰鲜鱼以及仅用鲜活鱼或冰鲜鱼饲喂,均能够使部分中华鲟性腺发育启动,但添加鲜活鱼或冰鲜鱼组性腺发育启动的比例较高,其中,有3尾中华鲟性腺达IV期。成功对性腺发育至IV期的1尾雌鲟(12龄,体质量57 kg)和1尾雄鲟(14龄,体质量64 kg)实施了人工催产和授精,采获卵6.25万粒,精液2 850 mL,受精率为60.1%(36.3%~80.4%)。在(19.3±0.2)℃下经过约125 h,仔鱼大量孵出,获初孵仔鱼2.3万余尾。此次中华鲟全人工繁殖技术研究的有效尝试可为今后养殖中华鲟的规模化繁育提供借鉴。