瓦氏黄颡鱼精子的生理特性及其超低温冷冻保存的初步研究

对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)精子在不同盐度和pH下的精子活力进行观察,同时研究了精子在4种不同稀释液与2种不同浓度抗冻剂组成的保存液中的超低温冷冻保存,并开展了冻精的授精实验。结果表明,瓦氏黄颡鱼精子浓度为(2.035±0.179)×1012cell·mL-1,在盐度为5.8、pH为7.17时,精子的活力都高达95%。以A液作为稀释液、10%甲醇作为抗冻剂时,冷冻保存精子效果最好,解冻后精子活力为(81.7±0.9)%。用解冻后的精子进行人工授精,获得的受精率为(88.4±2.1)%,孵化率为(74.0±0.8)%;而鲜精受精率为(91.0±0.8)%,孵化率(82±1.6)%,冻精与鲜精均无显著性差异。人工授精实验证明了解冻后的精子能正常用于该鱼的人工繁殖。     

小球藻和亚心扁藻的超低温保存

实验采用两步法冷冻技术低温保存小球藻和亚心扁藻,通过冻存后再培养的生长情况的研究,检验两步法冷冻技术低温保存藻种的可行性。实验利用两种不同的抗冻剂对各藻类分别进行预处理、冷冻保存、解冻、再培养,测定相应波段的吸光光度值,以计算叶绿素a的含量,反映各藻类的生长情况。实验结果显示,各藻类经冻存后均有成活,但不同藻在经过不同抗冻剂处理后的生长速度有所不同。     

达氏鲟精巢细胞消化分离和超低温冷冻保存

通过研究两种酶对精巢细胞的消化效果,探究抗冻剂、降温程序、糖类和卵磷脂对达氏鲟(Acipenser dabryanus)精巢细胞冻存效果的影响,获得消化冻存后高存活率的细胞。实验使用0.25%胰蛋白酶和2 mg/m L胶原酶H+500 U/m L中性酶II的组合酶对达氏鲟精巢细胞进行消化,获得不同消化时间内的活细胞数量。另外,还研究了冷冻稀释液中分别添加10%二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甲醇(MET)作为抗冻剂,采用-1℃/min慢速降温以及直接投入液氮中的快速降温方法冻存,冷冻稀释液采用D-海藻糖或同浓度D-蔗糖,以及添加5%、8%、11%卵磷脂对冻存效果的影响。结果显示:两种消化酶在同一时间消化所得的活细胞数和活细胞率无显著差异,并且都在3 h获得最多活细胞。慢速降温的冻存效果极显著地好于快速降温(P=0.01)。不同抗冻剂的保存效果差异显著,复苏后细胞相对存活率EG(51.70%±5.24%)MET(45.09%±3.15%)DMSO(40.18%±3.90%)。不同糖对达氏鲟精巢细胞冻存效果无显著影响;不同浓度的卵磷脂冻存效果有极显著差异。含8%卵磷脂的冻存液对细胞的冻存效果最好,细胞存活率可达(93.55±2.56)%,培养10 d后细胞数目为0 d时的3.19倍。     

云纹石斑鱼精子冷冻保存

以云纹石斑鱼精液为实验材料,对精子稀释液、抗冻剂种类和适宜浓度、冷冻保存液进行了筛选。结果表明,利用9g/L NaCl、10g/L KHCO3和10%小牛血清配制而成的稀释液EM1-2适宜于云纹石斑鱼精子冷冻保存,以2ml冷冻管为精子容器,在60L液氮生物保存罐中冷冻保存精子,冷冻解冻精子活力可达56.67%±5.77%,要优于TS-2、ES1-3和其他EM系列稀释液冷冻保存精子活力。利用EM1-2为基础液对抗冻保护剂进行筛选,结果显示,10%~20%的二甲基亚砜(DMSO)和1-2-丙二醇(PG)冷冻保存后精子活力无显著差异(P0.05),其中15%的DMSO和10%PG冷冻保存精子效果最优,解冻后精子活力分别可达54.52%±7.81%和57.24%±3.69%。利用冷冻保存1年的精液与云纹石斑鱼卵进行受精,受精率和孵化率均达到80%以上,与新鲜精子无显著性差异(P0.05)。本研究表明,利用EM1-2配制15%的DMSO或10%的PG可用于冷冻保存云纹石斑鱼精液。在此基础上,建立了精子冷冻库,保存精子130ml,为人工繁育和杂交育种提供了丰富的精子源。     

云纹石斑鱼精子冷冻保存

以云纹石斑鱼精液为实验材料,对精子稀释液、抗冻剂种类和适宜浓度、冷冻保存液进行了筛选。结果表明,利用9g/L NaCl、10g/L KHCO3和10%小牛血清配制而成的稀释液EM1-2适宜于云纹石斑鱼精子冷冻保存,以2ml冷冻管为精子容器,在60L液氮生物保存罐中冷冻保存精子,冷冻解冻精子活力可达56.67%±5.77%,要优于TS-2、ES1-3和其他EM系列稀释液冷冻保存精子活力。利用EM1-2为基础液对抗冻保护剂进行筛选,结果显示,10%~20%的二甲基亚砜(DMSO)和1-2-丙二醇(PG)冷冻保存后精子活力无显著差异(P0.05),其中15%的DMSO和10%PG冷冻保存精子效果最优,解冻后精子活力分别可达54.52%±7.81%和57.24%±3.69%。利用冷冻保存1年的精液与云纹石斑鱼卵进行受精,受精率和孵化率均达到80%以上,与新鲜精子无显著性差异(P0.05)。本研究表明,利用EM1-2配制15%的DMSO或10%的PG可用于冷冻保存云纹石斑鱼精液。在此基础上,建立了精子冷冻库,保存精子130ml,为人工繁育和杂交育种提供了丰富的精子源。     

人工养殖西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存研究

研究了人工养殖西伯利亚鲟精子的生物学特征及超低温冷冻保存方法。西伯利亚鲟的产精量为113.67±39.86 ml,精子密度为(6.49±3.10)×108/ml,精子活力为(85.4±9.5)%,精子寿命为353±23 s。精子密度与精子快速运动时间、精子寿命之间均存在线性相关,用方程分别表示为:y=1.0384x+1.5089(R2=0.7325);y=2.9069x+74.289(R2=0.6967)。结果表明精子密度可作为一项精子质量评价的标准。通过比较西伯利亚鲟精子在不同稀释液、不同抗冻剂和抗冻剂浓度、降温速率、解冻温度下的保存效果,结果表明:配方2作为稀释液,18%甲醇作为抗冻剂,二步法超低温(-196℃)冷冻保存精子,40℃水浴解冻取得最好的冻后活力,解冻后活力为(51.8±5.8)%。西伯利亚鲟授精的最佳精卵比为106∶1。在此精卵比下用冻精授精分别得到了(72.3±3)%的受精率和(52.9±4.1)%的孵化率,其中受精率与鲜精没有显著性差异,孵化率与鲜精有显著差异(P<0.05)。     

４种渗透性抗冻剂对暗色唇鱼精子冷冻保存的影响

4℃冷冻保存条件下,以冷冻精子活力、寿命和细胞膜完整率为指标,检测二甲亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、乙二醇(EG)和甲醇(MeOH)4种渗透性抗冻剂对暗色唇鱼(Semilabeo obscurus)鲜精以及对精子冷冻保存效果的影响.结果显示,4种渗透性抗冻剂对鲜精活力呈负作用,MeOH＜ EG＜ DMSO＜ Glycerol;抗冻剂对鲜精寿命呈负作用,MeOH＜ EG＜ DMSO和Glycerol;抗冻剂对鲜精细胞膜完整率呈负作用,MeOH＜ EG＜ DMSO＜ Glycerol.在鲜精活力为(36.17±4.06)％,寿命为(47.5±3.1)s,细胞膜完整率为(86.22 ±5.29)％时,经过短期冷冻保存,5％ MeOH和5％ EG解冻后暗色唇鱼精子活力最高,分别为(18.33±1.70)％和(17.83±2.67)％,与鲜精活力差异显著(P＜0.05);5％ MeOH和5％ EG解冻后精子寿命最长,分别为(44.3±3.6)s和(42.8±5.5)s,5％MeOH解冻后精子寿命与鲜精寿命差异不显著(P＞0.05);5％ MeOH解冻后精子细胞膜完整率最高,为(85.67±1.11)％,与鲜精细胞膜完整率无显著差异(P＞0.05).研究表明,DMSO和Glycerol并不适合作为暗色唇鱼精子冷冻的抗冻剂,MeOH和EG具有相似的保护作用,是暗色唇鱼精子冷冻保存潜在的渗透性抗冻剂.     

海藻糖对施氏鲟精子冷冻保存效果的影响及其冷冻损伤机理的初步探究

为了解抗冻剂对施氏鲟(Acipenser schrenckii)精子冷冻保存效果的影响及其冷冻损伤机理,比较了添加不同浓度海藻糖和蔗糖作为冷冻保护剂的精子稀释液处理后施氏鲟精子冷冻复苏的活力、快速运动时间和寿命。结果表明,添加60 mmol·L^-1海藻糖1.0 mmol·L^-1氯化钾的稀释液处理后,精子冻后快速运动时间和寿命与鲜精相比无显著差异(P>0.05);且活力较其他处理组有所提高,达到(26.67±3.32)%,但仍显著低于鲜精(P<0.05)。利用透射电镜和扫描电镜对施氏鲟精子超低温冷冻保存前后的超微结构进行观察,并对其能量代谢酶和抗氧化酶活进行测定和比较,结果表明,低温冻存造成施氏鲟精子的膜系统和细胞器(主要为线粒体和轴丝)损伤;能量代谢酶[总ATP酶、肌酸激酶(CK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)]和抗氧化酶[过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)]活性均显著下降(P<0.05),而抗氧化酶谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著上升(P<0.05),表明...     

野生和养殖棘头梅童鱼肌肉营养成分分析及比较

采用生理生化方法,对野生和养殖棘头梅童鱼肌肉常规营养成分、氨基酸和脂肪酸组成进行了测定.结果表明,与野生棘头梅童鱼相比,养殖棘头梅童鱼肌肉中粗脂肪含量较低,水分含量较高,且差异显著(P<0.05),蛋白质和灰分含量则无显著性差异(P>0.05);在氨基酸方面,野生和养殖棘头梅童鱼肌肉中均检出18种氨基酸,其中养殖组的酪...     

超低温冷冻对俄罗斯鲟精子顶体酶活性及DNA损伤的影响

选取6 ind健康的雄性俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti),经人工催产后获得成熟的精子,研究超低温冷冻(-196℃)对俄罗斯鲟精子顶体酶活性及DNA损伤影响。结果显示:俄罗斯鲟鲜精中顶体酶的平均活性为(36.18±2.54)μIU·10-6,经过超低温冷冻后,精子顶体酶活性显著降低,添加抗冻保护液精子中顶体酶活性降至(21.55±0.79)μIU·10-6,未添加抗冻保护液精子中顶体酶活性降至(9.58±1.08)μIU·10-6,且三者间有显著性差异(P0.05)。单细胞凝胶电泳结果表明,俄罗斯鲟鲜精彗星率为(37.33±7.77)%,添加抗冻剂后冻精的彗星率为(63.67±5.13)%,未添加抗冻剂直接冷冻彗星率高达(86.00±3.61)%,三者间有显著差异(P0.05)。用CASP分析软件分析测量彗星拖尾长度(L tail)、彗星尾部DNA的相对含量(Tail DNA)、尾动量(TM)、Olive尾动量(OTM)等各项表征DNA损伤的指标,发现冻精组的各项指标均显著高于鲜精组,未添加抗冻剂直接冷冻组又高于添加抗冻剂组,3组间有显著性差异(P0.05)。本研究结果表明:超低温冷冻能导致精子顶体酶活性下降和DNA损伤,抗冻剂对精子具有保护作用。