高效快速甘蔗转基因方法探索

甘蔗遗传背景复杂,转基因技术是甘蔗品种遗传改良的重要途径。甘蔗转基因遗传改良主要是通过基因枪法和农杆菌介导法来实现,但目前我国的甘蔗转基因技术,普遍存在转基因效率偏低,获得的转基因株系偏少,难以筛选到目的基因稳定表达、有利用价值的转基因株系等问题。本实验室通过多年的经验积累,建立了一种高效快速的农杆菌介导法的甘蔗转基因方法。转化效率为20%,筛选效率达到90%,转化时间为4个月,操作简单,成本较低。     

转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

本研究对已获得的转α-微管蛋白基因SoTUA的T₂代甘蔗株系进行PCR扩增及测序,从检测阳性的转基因甘蔗中选6个转基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）与非转基因野生型甘蔗对照（WT）进行了低温胁迫（4 ℃）处理,在处理0、5、10 d测定甘蔗叶片丙二醛（MDA）和渗透调节物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,并采用RT-qPCR法分析了低温处理下甘蔗叶片α-微管蛋白基因的表达情况。结果表明：在4 ℃低温处理下,6个转SoTUA基因甘蔗与WT中α-微管蛋白的转录因子表达量随着胁迫时间的延长上调表达。胁迫后5、10 d转基因株系的相对表达量始终高于WT甘蔗,低温处理10 d时转基因T1显著高于其他株系（P<0.05）。在低温胁迫下,甘蔗的MDA含量逐渐增高,而转基因甘蔗增幅显著低于WT甘蔗,10 d时转基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之间变化趋势不同,但转基因甘蔗POD活性显著高于WT甘蔗（P< 0.05）;转基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性随着胁迫天数增加呈现先增加后减少的趋势,而WT与转基因T3、T5的SOD活性逐渐升高;甘蔗的可溶性糖含量逐渐上升,转基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d显著高于野生型甘蔗,胁迫后变化趋势在株系之间有所差异;转基因甘蔗SoTUA相对表达量与可溶性糖含量呈极显著的正相关。利用隶属函数综合分析评价,抗寒性排序结果为：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低温胁迫下,转基因甘蔗SoTUA基因的上调表达能提高甘蔗的抗寒性,且具有遗传稳定性。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

2种不同启动子驱动下1-SST基因转化甘蔗的抗旱性比较

将从菊芋中克隆到的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因(即1-SST基因),与根部特异性表达启动子pPST2a组合,通过农杆菌介导法获得转pPST2a:1-SST基因甘蔗植株,通过分子检测共得到15个阳性转基因株系。将前期工作得到的转rbcs:1-SST基因甘蔗5个株系与转pPST2a:1-SST基因甘蔗进行抗旱性比较。结果发现,转pPST2a:1-SST基因甘蔗的抗旱性高于转rbcs:1-SST基因甘蔗。与启动子rbcs相比,启动子pPST2a能够更大程度上增强转1-SST基因甘蔗植株的抗旱性。     

转TaNHX2基因大豆的抗旱性鉴定

本研究利用转TaNHX2基因大豆T3代株系,研究其在干旱胁迫情况下表型、生理特性、生物量与光合作用等方面的变化。结果表明:随着干旱时间的不断延长,对照表现出明显的萎蔫,且转基因植株能够持续地保持绿色状态。转基因植株叶片中含水量高于对照,但株系间叶绿素和可溶性糖含量差异不大,转基因植株中的脯氨酸和丙二醛含量明显低于对照,SOD的活性高于对照。综合评价表明转TaNHX2基因大豆T3代株系比对照具有更强的耐旱性。     

转玉米C4型高光效pepc基因小麦的分子特征及光合特性研究

为分析转pepc基因小麦的分子遗传特征和光合生理特性,以基因枪介导转玉米C4型pepc基因的T3代转基因小麦株系为实验材料,对其进行PCR筛选、Southern杂交、qRT-PCR、Western杂交、酶活性和光合速率测定,鉴定了pepc基因在小麦基因组中的整合及表达情况,并分析了转基因株系的光合生理特性和产量性状表现。结果表明,玉米C4型pepc基因以1～3个拷贝的方式被整合到6个转基因株系的不同位点,且可以正确转录和翻译;6个转基因株系中有4个株系的pepc基因表达水平、PEPC酶活性和净光合速率均较对照显著提高,2个株系的单株重、单株产量和千粒重显著高于对照;抽穗期转基因株系的PEPC酶活性最大值为1.6μmol·min-1·mg-1,较对照提高了1.6倍;净光合速率最大值为29.5μmol·m-2·s-1,较对照提高了15.5%。说明,玉米C4型pepc基因可以在小麦基因组中整合表达,并可改善小麦的光合特性。     

盐生草HgNHX1基因在大麦株系中的功能验证

为了探讨盐和干旱环境胁迫对转盐生草液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HgNHX1大麦幼苗生长及抗逆性生理指标的影响,以转HgNHX1基因大麦及野生型株系为材料,分析盐(150 mmol· L^-1 NaCl)和自然干旱环境下转基因大麦幼苗的生长特性及生理指标的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,随着胁迫时间的延长,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量逐渐上升;干旱胁迫条件下,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量呈先上升后下降的趋势,在处理3 d时达到最高。且在胁迫处理的三个不同时间点,转基因株系的相对含水量和游离脯胺酸含量均高于野生型株系,而相对电导率和丙二醛含量均低于野生型株系。这些结果说明,转基因株系中HgNHX1基因能够应答盐和干旱胁迫,具有提高大麦耐盐、抗旱性的功能。     

多重PCR快速检测甘蔗转基因成分研究

以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物,通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化,建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明:建立的体系一次能有效检测5个参数,其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%,并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。     

转BcWRKY1转录因子基因玉米耐盐性鉴定方法的建立及高耐盐株系的筛选

试验以32份转BcWRKY1转录因子基因的玉米株系为材料,针对不同受体材料筛选出耐盐性鉴定浓度,通过苗情观察和生理生化指标对转基因株系进行耐盐性鉴定,建立转基因玉米苗期耐盐性鉴定的方法,同时筛选耐盐性强的玉米新种质,为玉米抗逆性育种提供种质资源。结果表明,耐盐性筛选及鉴定的NaCl适宜浓度为300mmol/L。依据苗情观察评价方法,23份转基因材料耐盐性比受体对照提高了一个级别;依据苗期生理生化指标变化情况,建立了转基因后代株系耐盐性比对照提高程度的评定方法。32份试材中耐盐性比对照提高3级的株系有3份。     

转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物群落多样性的影响

应用Biolog Eco微平板法研究了转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响.结果表明:转基因甘蔗根际土壤微生物利用单一碳源能力(A WCD)在整个培养过程都显著高于非转基因甘蔗的根际土壤微生物；转基因甘蔗和非转基因甘蔗根际土壤样品的Simpson指数(I/D,优势度)、Shannon-Wiener指数(H,物种丰富度)、Mclntosh指数(U,物种均一性)均存在差异,其中转基因甘蔗根际土壤微生物的Simpson指数、Mclntosh指数均显著高于非转基因甘蔗土壤微生物;主成分分析也表明转基因甘蔗与非转基因甘蔗土壤微生物对不同的碳源有特异利用,起分异作用的主要碳源是糖类,其次是脂肪酸和脂类.表明转基因甘蔗根系在生长期可能诱导了具有某些特定生理特征的微生物群落的发展,因此改变了土壤微生物群落的功能多样性,总体表现较高的活性.     

乙烯利对不同甘蔗品种气体交换的影响

选用4个熟性不同的甘蔗品种桂糖11号、桂糖17号、新台糖10号、新台糖20号作为供试材料,在甘蔗生长前期以100mg/L乙烯利进行叶面喷施,研究乙烯利处理对几个甘蔗品种气体交换的影响。结果表明:1.乙烯利处理可以提高甘蔗的净光合速率和蒸腾速率,但对不同品种的效应不同,尤以对桂糖11号和新台糖10号的效应最显著;2.甘蔗的净光合速率对光强的响应曲线表明,乙烯利处理可以提高净光合速率对光强响应曲线的斜率,说明乙烯利处理有利于蔗株对光强的利用,从而提高甘蔗的净光合速率;3.甘蔗的净光合速率的日变化曲线为单峰曲线,其净光合速率最大值出现在大约上午11:00左右,乙烯利处理后净光合速率的变化曲线的峰形不变,但处理的峰值提高的幅度更大。      

粉垄耕作对甘蔗光合生理特性及产量品质的影响

为了探明粉垄耕作下甘蔗光合生理特性与甘蔗高质高产的相关性,阐明粉垄条件下甘蔗光合生理特性的响应,以‘桂糖42号’为供试品种,设常规耕作（CK）和粉垄耕作（粉垄）共2个处理,采用田间随机区组设计,每个处理设3次重复。结果表明：甘蔗伸长期,粉垄甘蔗的叶绿素含量、苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）活性、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶（RuBPC）活性分别比常规耕作甘蔗提高5.4%、18.6%、23.5%和30.9%,差异均达显著。此外,粉垄甘蔗的净光合速率（P_n）、气孔导度（Cond）、蒸腾速率（T_r）在伸长期和成熟期也显著大于对照。粉垄耕作下甘蔗单茎重、茎长、茎径、有效茎与理论产量等农艺性状均达到显著差异,单茎重提高32.7%,茎长增加13.1%,茎径增加17.6%,有效茎数量提高5.3%,理论产量增加20741 kg/hm ²;纯度、锤度、蔗汁糖分和甘蔗糖分等工艺品质也均达显著差异,分别提高5.2%、9.0%、14.5%和13.4%。粉垄耕作能提高甘蔗伸长期光合作用相关的酶活性、叶绿素含量和净光合速率等生理指标,提高了光合作用,促进甘蔗生长,提高甘蔗产量与品质。     

转ScMV-CP基因甘蔗对土壤微生物的影响

通过盆栽、田间种植及人工残体掩埋,利用BIOLOG EcoplateTM微平板(BIOLOG Inc., USA)结合微生物的平板培养及相关的土壤酶活性分析研究了转ScMV-CP基因甘蔗对根际土壤微生物的影响.结果表明:在盆栽和田间种植时,转基因甘蔗根际土壤的细菌总数增加,但差异不明显.转基因甘蔗对根际土壤放线菌总数没有影响,但显著提高了根际土壤真菌总数.在转基因甘蔗根际土壤中的脲酶活性显著比非转基因甘蔗的高;土壤蔗糖酶的活性比对照的低,但差异不显著.转基因甘蔗对磷酸单脂酶的活性影响很小.转基因甘蔗残体掩埋对土壤微生物和土壤酶活性没有影响;BIOLOG Ecoplate接种96h后土壤微生物多样性指数分析显示,除了在田间种植时,转基因甘蔗根际细菌生理群分布的均匀度显著下降(p<0.01)外,土壤微生物的Simpson指数(D')、Shannon-Wiener指数(H')、Mclntosh指数(DMc)等多样性指数均差异不明显.初步研究结果表明,转基因甘蔗对土壤微生物的数量和均匀度有一定影响,但对其活性和多样性则影响不明显.     

转Bt基因玉米对亚洲玉米螟的抗性及其农艺性状研究

以普通玉米杂交组合N3030、N4640为对照,通过盆栽接虫试验和田间调查,系统研究了转Bt基因玉米杂交组合N3030Bt和N4640Bt对亚洲玉米螟的抗虫效果和主要农艺性状变化。结果表明,转Bt基因玉米对亚洲玉米螟产卵无驱避作用,但花叶率、茎秆和雌雄穗的受害程度均明显轻于对照;转Bt基因玉米的生育期、株高、穗位高、穗长、穗粗等与对照差异不大,秃尖长明显短于对照,穗粒数和产量明显高于对照。     

Susceptibility of Brazilian populations of Diatraea saccharalis to Cry1Ab and response to selection for resistance

The sugarcane borer, Diatraea saccharalis (F.), is a key pest of sugarcane and other grasses, which is a current focus of research aiming to develop transgenically resistant genotypes. However, the current susceptibility of Brazilian populations of the sugarcane borer to Bt toxins is unknown. Laboratory assays were carried out to characterize the susceptibility of sugarcane borer to the Bt toxin Cry1Ab and to select a resistant strain for additional studies on Cry1Ab resistance. Susceptibility was characterized by exposing neonates of different Brazilian colonies of sugarcane borer to different concentrations in meridic diet using surface application of Cry1Ab toxin. Selection for Cry1Ab resistance was carried out by exposing neonates to Cry1Ab-expressing maize (MON 810). The resistance of the borer populations to Cry1Ab was variable with LC₅₀ and EC₅₀ values reaching about 30-fold. The larvae responded positively to Cry1Ab selection exhibiting a 55-fold increase in resistance after four generations. This suggests the suitability of using leaves containing Bt-expressing genes for selection and the existence of variability of Bt-resistance in populations of the sugarcane borer.     

20个甘蔗品种（系）的抗旱性比较

干旱是限制我国甘蔗产量提高的主要原因。采用桶栽和人工控水的方法,对云南省甘蔗主产区临沧市选取的20个甘蔗品种（系）进行抗旱性分析,通过测定苗期和分蘖期的8个抗逆生理指标,以及分蘖率、成活率和株高3个生长指标,采用模糊隶属函数、主成分分析和系统聚类分析方法对各甘蔗品种（系）的抗旱性进行综合评价。结果表明,干旱胁迫后,甘蔗叶片相对含水量、叶绿素含量、甘蔗分蘖率、株高和成活率呈下降趋势,而甘蔗叶片丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量、质膜透性、SOD和POD酶活性则呈上升趋势。通过模糊隶属函数、主成分分析和系统聚类分析可将20份甘蔗品种（系）材料分为3类,其中7个为抗旱品种（系）,6个为中等抗旱品种（系）,7个为不抗旱品种（系）;根据抗旱综合值,7个抗旱品种（系）的抗旱能力排名为：‘桂糖06-2081’>‘柳城05-136’>‘福农38’>‘柳城03-1137’>‘德蔗03-83’>‘云蔗05-49’>‘福农40’。相关分析表明,与甘蔗抗旱性呈显著正相关的指标分别为成活率、株高和叶片相对含水量,呈显著负相关的指标分别为质膜透性、脯氨酸和可溶性糖含量。     

转Bt毒蛋白基因玉米及其抗虫性研究进展

本文从转Bt毒蛋白基因玉米的培育及商品化，Bt毒蛋白基因在转基因玉米中的遗传分离与整合、对玉米螟及其它害虫的杀虫效果、对天敌种群数量和玉米病害发生程度的影响、玉米螟对转Bt毒蛋白基因玉米产生抗性及解决措施、应用转Bt毒蛋白基因玉米潜在的生态风险性等方面对国内外最新研究进展进行了综述。