利用多重PCR技术快速检测五个转基因大豆品系

转基因大豆305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043作为商品化应用最为广泛的大豆品系,种植面积占世界转基因大豆总种植面积的80%以上。根据大豆内标准基因Lectin和5种转基因大豆品系的边界序列设计特异性引物。通过验证引物的适用性、特异性和灵敏度,优化多重PCR检测体系中不同引物的用量及反应退火温度,建立了能同时扩增大豆内源基因Lectin和5个转基因大豆品系的六重PCR检测体系。结果表明:确定的大豆内源基因和5个转基因大豆品系的引物具有很好的特异性,引物之间无交叉扩增和非特异性扩增,多重PCR方法的检测灵敏度达到0.1%。该方法可作为转基因大豆及其产品成分检测的辅助手段,快速检测转基因大豆及其产品中的相应品系。     

转基因小麦的定性PCR筛选检测技术

为了建立转基因小麦的PCR检测方法标准,以B73、B72、B102三个被转入外源高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的转基因小麦品系为材料,对目前国内外转基因小麦中通用的标记基因bar和uidA、NOS终止子和Ubiquitin启动子进行了定性PCR的筛选检测,在国内外首次找到了小麦中特有的内参照基因麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成了麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D)和Ubiquitin启动子的引物序列,并对PCR反应条件进行了优化,PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,可以检测到预期大小的目的片段.同时对PCR产物用实时荧光定量PCR进行了确证实验,并得到预期的结果.定性PCR最低检测灵敏度为0.5%(w/w).建立的转基因小麦定性PCR筛选检测方法具有通用性.     

多重PCR技术在橡胶树转基因分子鉴定中的应用

为了同时检测橡胶树转基因胚状体和叶片中含有的多个目标基因序列,并排除扩增结果的假阴性,利用正交试验首次建立了橡胶树管家基因(HbActin)、目标基因新霉素磷酸转移酶II(NptII)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的多重PCR检测体系。利用2种酶(PCR Mix酶和Taq酶)对18个转基因胚状体和叶片进行单一引物PCR扩增和多重PCR检测。结果表明:多重PCR检测结果与单一PCR结果完全一致,且多重PCR体系带型清晰,无非特异性扩增,更易读取。多重PCR检测系统具有简单、准确并且高效等特点,只需要进行一个反应就可以检测多个目标基因序列,因而在转基因分子鉴定上具有非常重要的应用价值与潜力。     

应用多重荧光PCR快速筛查作物中转基因成分研究

通过对我国批准进口的和获得农业转基因生物安全证书的转基因玉米转化体的序列分析发现,除DAS40278-9和BLVA430101外,CaMV35s启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因和pat基因覆盖了21种玉米转基因转化体。通过引物组合筛选、反应体系优化、灵敏度测试、适用性测试等实验,建立了基于4个通用筛选元件及zSSIIb内源基因的五重荧光PCR和基于转化体特异性序列的二重荧光PCR检测转基因成分方法体系。方法参数测定结果表明,此方法特异性强、稳定性好,检测灵敏度达到0.05%。同时,此方法体系不仅适用于转基因玉米成分筛查,对大豆、水稻等多种作物进行转基因成分筛选鉴定也有良好的适用性。     

应用PCR-DHPLC技术高通量快速检测转基因玉米

利用多重PCR结合DHPLC技术首次建立转基因玉米高通量快速检测方法。根据公布的转基因玉米外源基因序列设计并合成适合多重PCR的引物序列,以转基因玉米为模板,通过优化多重PCR和DHPLC的反应条件,建立一套同时快速筛选检测玉米中多种转基因成分的7重PCR-DHPLC检测方法。该方法的检测灵敏度为0.195 ng/μL,质粒检测灵敏度为1×103拷贝/μL。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

种子DNA快速提取法在玉米转基因检测中的应用

利用一种快速玉米基因组DNA提取方法,分别对Bt11、MON810、NK603、MIR604和TC1507这5种转基因玉米种子的胚和胚乳进行DNA提取。根据不同转基因玉米重组结构点,分别设计特异性引物,参考农业部转基因检测标准,通过对PCR体系的优化整合后发现,该玉米DNA快速提起法获得的PCR检测结果准确、可靠,在此基础之上建立一套多重PCR,使转基因检测的效率得到很大提高。     

706份常规大豆品系转基因成分筛查及检测

为调查分析我国的常规大豆育种材料中是否混入转基因大豆品系,选取706份大豆品系,对可能含有的 外源转基因调控元件（CaMV35S启动子、FMV35S启动子和NOS终止子）以及针对我国批准进口的主要耐除草剂转 基因大豆转化体（GTS40-3-2和MON89788）成分进行PCR扩增,同时根据MON89788转化体侧翼序列和目的基因 设计引物做特异性检测,为其定性检测提供技术支撑。结果表明,在选取的所有样品中,最终测得含有CaMV35S启 动子的转基因成分所占比例为1％,含有FMV35S启动子的转基因成分所占比例为0.85％,含有NOS终止子的转基 因成分所占比例为0.71％,耐除草剂转基因品系MON89788所占比例为0.85％,以此评估转基因大豆所占比例,为 农业转基因监管部门开展转基因大豆监管工作提供数据支持。     

应用直接PCR技术快速筛查转基因玉米方法研究

以转CP4-epsps基因玉米为研究对象,用玉米内标准基因z SSIIb及3种常见转基因成分(Ca MV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基因)为检测靶标,建立基于直接PCR技术的玉米转基因成分筛查方法。此方法不用提取纯化DNA,只需取直径约为0.5 mm的叶片加到PCR反应体系中进行扩增,与常规PCR方法相比,在保证结果准确性的同时,大大缩短检测时间,提高工作效率。此方法具有操作简便、结果可靠等优点,适用于玉米叶片中转基因成分的快速筛查。     

痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR检测

研究成功建立了痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR(Semi-nested PCR)检测方法，灵敏度比常规PCR提高了100倍。该方法通过改良CTAB法提取并纯化得到不同梯度浓度的DNA模板溶液。设计了4个外源基因的特异性半巢式PCR引物，以油菜籽磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)为内标准基因，对油菜籽混合样品中外源FMV35S启动子、GOX、BARSTAR和BARNASE基因进行了检测，灵敏度达到0.001%。     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

应用多重PCR-DHPLC方法快速检测转基因马铃薯及EH92-527-1品系鉴定

以EH92-527-1转基因马铃薯为试材,应用多重PCR技术同时扩增马铃薯的内源基因(UGPase)和外源基因(NOS终止子、NPTII结构基因和EH92-527-1品系特异基因),将扩增产物在DHPLC非变性条件下分离,分析几个基因扩增的结果;将模板进行稀释,确定了方法的检测灵敏度,并与凝胶电泳结果相比较,建立了马铃薯转基因成分筛选检测及品系鉴定的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)方法。试验结果表明,该方法能够同时筛选检测转基因马铃薯的四个内、外源基因,且与凝胶成像相比,有更好的检测灵敏度,可达到1 ng/μL。本文首次建立的马铃薯多重PCR-DHPLC检测方法,能够高通量快速准确的检测马铃薯中的转基因成分及对品系进行鉴定。     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

对引进的美国大豆品种进行转基因成分的检测

利用田间表型鉴定和PCR检测相结合的方法,对从美国引进的46个大豆品种进行了转基因成分的检测.实验过程中,首先通过喷洒草甘膦对待测材料进行表型鉴定,然后通过PCR分子检测分析CaMV35S启动子和NOS终止子的有无,初步判定引进材料是否为转基因大豆,最后对目的基因CP4-EPSPS进行检测,进一步确定所测材料是否为抗草甘膦转基因大豆.大豆本身的凝集素基因作为PCR检测的内置检测标准,有效排除了由于DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,在所检测的46个引进品种中,5个是抗草甘膦转基因品种,41个是非转基因品种,它们可作为我国大豆新品种选育的亲本材料.     

GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗

利用经人工改造的gna基因分别与Ubi、Rbcs启动子组合,构建抗虫植物表达载体pUNG和pRNG,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经PPT筛选和PCR检测,获得Ubi-gna转基因植株124株,Rbcs-gna转基因植株35株。对部分转基因植株进行RT-PCR检测,初步证明外源基因已经整合到甘蔗基因组中,并得到有效表达;对RT-PCR阳性植株进行GNA(植物外源凝集素)活性测验,结果表明,甘蔗叶片表达的凝集素可以使健康公鸡的红细胞凝集,初步证明表达的GNA具有正常的生物学活性。