盐生草Actin基因片段的克隆及表达

根据藜科植物的肌动蛋白(Actin)基因编码区保守序列设计一对简并引物,提取盐生草(Halogeton glomeratus)叶片的总RNA,运用RT-PCR技术扩增出Actin基因的核心序列并连接到pMD19-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析表明,盐生草Actin基因核心序列长度为598bp,编码198个氨基酸,并在GenBank中注册,登录号为KF699314,由盐生草Actin基因推导的氨基酸序列与其他几种耐盐植物的同源性均在94%以上,具有高度的保守性。采用荧光定量RT-PCR技术分析其Actin基因在盐生草不同器官的表达情况,结果显示其表达量恒定无差异,表明克隆的Actin基因可作为盐生草内参基因来研究其相关耐盐基因的表达。     

啤酒大麦品种甘啤4号成熟胚再生体系的建立

建立啤酒大麦品种甘啤4号成熟胚再生体系可为其遗传转化奠定基础。本研究以甘啤4号成熟胚为材料,研究不同诱导培养基对其愈伤组织诱导及分化的影响,并通过添加不同浓度梯度的Ag NO3(0,2.5 mg/L,5.0 mg/L,7.5 mg/L,10.0 mg/L,15.0 mg/L)和ABA(0,0.1 mg/L,0.3 mg/L,0.5 mg/L,0.7 mg/L,1.0 mg/L),观察其愈伤组织形态变化,统计出愈率、绿点率,探索适宜甘啤4号成熟胚组织培养的条件。同时在0、7 d、14 d、21 d和二叶期分别测定成熟胚再生过程中SOD、POD、CAT活性、MAD、可溶性蛋白及内源激素(IAA,ABA,GA3)的含量,为优化成熟胚再生体系准备条件。研究结果表明:培养基NMB较适宜甘啤4号成熟胚再生培养,发现添加适量Ag NO3和ABA有助于愈伤组织的诱导及分化,但Ag NO3处理的效果较ABA明显,其诱导甘啤4号愈伤组织的最适浓度分别为7.5 mg/L和0.5 mg/L;观察到不同时期酶活性大致均呈现先上升后下降的趋势,内源激素含量也随着培养时期的不同有所差异。研究结果可为添加外源激素、进一步优化培养条件奠定了基础。     

盐生草HgNHX1基因在大麦株系中的功能验证

为了探讨盐和干旱环境胁迫对转盐生草液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HgNHX1大麦幼苗生长及抗逆性生理指标的影响,以转HgNHX1基因大麦及野生型株系为材料,分析盐(150 mmol· L^-1 NaCl)和自然干旱环境下转基因大麦幼苗的生长特性及生理指标的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,随着胁迫时间的延长,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量逐渐上升;干旱胁迫条件下,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量呈先上升后下降的趋势,在处理3 d时达到最高。且在胁迫处理的三个不同时间点,转基因株系的相对含水量和游离脯胺酸含量均高于野生型株系,而相对电导率和丙二醛含量均低于野生型株系。这些结果说明,转基因株系中HgNHX1基因能够应答盐和干旱胁迫,具有提高大麦耐盐、抗旱性的功能。     

青稞遗传多样性及其农艺性状与SSR标记的关联分析

利用92个SSR标记对108份青稞亲本材料进行多态性扫描,分析其遗传多样性,旨在寻找与农艺性状相关联的分子标记,为青稞杂交组合的配制及分子标记辅助育种提供依据。挑选48个多态性标记进行群体遗传结构分析,在此基础上采用Tassel 2.1 GLM (general linear model)和MLM (mixed linear model)方法进行标记与农艺性状的关联分析。共检测出156个等位变异,每个位点2~6个等位变异。供试群体的Shannon指数为0.6727~1.1368,材料间遗传相似系数为0.2250~1.0000,平均0.7585。通过群体遗传结构分析将供试材料划分成4个亚群。以GLM分析,发现12个与株高、穗长、穗粒数和分蘖数相关联的标记,对表型变异的解释率分别为11.5%~17.6%、19.4%~45.4%、15.4%~22.1%和29.2%;以MLM分析,发现8个与株高、分蘖数和小穗数相关的标记,各标记对表型变异的解释率分别为31.7%~49.8%、28.1%~37.2%、22.7%~32.7%。关联标记分布在基因组全部6个连锁群上。     

大麦条纹病侵染对大麦叶片蛋白组的影响

大麦条纹病由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起,是一种世界性病害.为进一步探索条纹病与大麦(Hordeum vulgare)的相互作用,以大麦品种甘啤6号和Issto为实验材料,在接种麦类核腔菌(代号DWC)7和21d后提取叶片蛋白,运用2-DE和质谱分析技术研究条纹病菌侵染后叶片蛋白质组学的变化.结果显示,与对照相比,甘啤6号和Isotta差异表达量在1.4倍以上的蛋白点28个,其中在甘啤6号中表达上调的蛋白点4个,下调的6个,诱导表达的2个,抑制表达的2个;在Isotta中,表达上调的蛋白点3个,下调的4个,诱导表达的4个,抑制表达的3个.质谱鉴定分析发现,表达上调的蛋白包括二磷酸核酮糖羧化酶A(2号蛋白点)、肌动蛋白(9号蛋白点)、核糖体再循环因子(ribosome-recycling factor,RRF)(10号蛋白点)、ATP合酶γ链(11和27号蛋白点)、琥珀酸脱氢酶(辅酶q)黄素蛋白亚基(15号蛋白点)和假定蛋白(26号蛋白点):表达下调的包括过氧化物还原蛋白(4号蛋白点)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,RuBisCo)(3、5、12、14、16和18号蛋白点)、ATP合酶CF1α亚基(13号蛋白点)、Ycf3蛋白(17号蛋白点)和α-1,4葡聚糖蛋白合酶(alpha-1,4-glucanprotein synthase,UTPG)(28号蛋白点);诱导表达蛋白包括假定蛋白(6号蛋白点)、脂氧合酶2(lipoxygenase 2,LOX2)(7号蛋白点)、捕光叶绿素a/b结合蛋白质(light harvesting chlorophyll a/b-binding protein,LHCP)(19号蛋白点)、3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase,PGK)(20号蛋白点)、凝集素(21号蛋白点)和ATP合酶γ链(22号蛋白点);抑制表达的蛋白包括RuBisCo(1、8、24和25号蛋白点)和二磷酸核酮糖羧化酶小链(ribulose bisphosphate carboxylase small chain,RuBPCase)(23号蛋白点)等.按照其功能分类,这些差异表达蛋白点分别参与了光合作用、蛋白质生物合成、植物防卫反应、能量代谢和细胞信号转导、细胞结构和纤维素生物合成等生理功能.这些差异表达蛋白可能与大麦响应条纹菌侵染过程有关,研究结果有助于从蛋白质水平揭示不同抗性大麦品种抗条纹病的抗性机制.     

播量和施肥对甘啤6号产量和品质的影响

为筛选出河西地区啤酒大麦高产优质栽培的适宜播量和施肥组合,以当地啤酒大麦主栽品种甘啤6号为材料,采用正交设计,研究了播量、氮肥、磷肥对该品种产量、籽粒品质及麦芽品质的影响。结果表明,播量、氮肥、磷肥组合对大麦产量、籽粒品质和麦芽品质影响显著。就产量而言,最佳播量为525 万粒·hm^-2,施氮最佳水平为180 kg·hm^-2,P₂O₅最佳水平为90 kg·hm^-2;对产量的影响表现为播量>氮肥>磷肥。播量在375万～525万粒·hm^-2范围内,籽粒蛋白质含量随播量的增加而下降,但播量达到600万粒·hm^-2时蛋白质含量又有所增加。籽粒蛋白质含量随着氮肥施用量的增加呈直线上升趋势,适量施磷可以在保证产量的同时,抑制蛋白质含量的增加;对蛋白含量的影响表现为氮肥>播量>磷肥,对千粒重的影响表现为播量>磷肥>氮肥。综合来看,在播量为525万粒·hm^-2、施氮量为120 kg·hm^-2、P₂O₅施用量为210 kg·hm^-2条件下,甘啤6号具有较高的籽粒产量和较低的蛋白质含量,且千粒重、整齐度和主要麦芽品质均达国家优级水平,因此该处理可作为河西地区甘啤6号实现高产优质的适宜播量与施肥组合。     

盐生草HgNHX1基因启动子的克隆及功能验证

为了进一步探明盐生草HgNHX1基因启动子的功能,从盐生草基因组中克隆了HgNHX1基因上游 5'侧翼调控区1523 bp的序列,即HgNHX1基因启动子(pHgNHX1)序列,并利用PlantCARE、PLACE等在线软件对HgNHX1基因5' 端上游序列进行预测和分析,发现该启动子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件外,还含有多个与盐、干旱、缺水、冷、伤害等逆境胁迫诱导有关的作用元件;同时具有生长素、脱落酸、赤霉素及乙烯等植物激素诱导响应的功能元件,表明分离得到的DNA片段具有典型启动子的一般特征。构建pBI-HgNHX1启动子植物表达载体并转化拟南芥和烟草,利用组织染色法鉴定转基因烟草和拟南芥的 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表达模式,发现在转基因拟南芥的各个器官均有GUS 酶的活性,说明pHgNHX1具有一定的组成型启动子活性。     

大麦种质资源磷利用效率的评价及其转录组分析

磷是维持作物生长发育的主要元素。磷矿作为磷肥的原料,是面临枯竭的不可再生资源,培育磷高效作物新品种势在必行。基于此,本研究对150份大麦种质的磷效率进行评价,筛选出磷高效和低效基因型材料,从形态、生理生化和分子水平上探讨了它们响应低磷胁迫的机制,主要结果有:1)通过盆栽试验对大麦种质进行正常磷和低磷水平处理,通过农艺性状分析发现不同基因型响应贫磷胁迫的策略差异较大,总体表现为生长发育迟缓、产量下降。综合评价各性状指标筛选出磷高效(GN121)和低效(GN42)基因型各1份。其中GN121在贫磷胁迫下株高、茎粗、穗长、穗粒数、穗质量和千粒质量较正常磷处理分别下降0.86%、2.50%、1.45%、4.17%、3.79%和4.31%,GN42的各项指标降幅分别为10.37%、15.39%、51.97%、31.25%、40.74%和27.03%。2)以田间施肥量及其1/10分别作为正常磷和贫磷处理水平,水培条件下GN121的长势受贫磷胁迫影响远小于GN42。对贫磷处理3、19 d及恢复供磷3 d后2份材料的生理生化指标进行分析,发现贫磷胁迫下干质量、无机磷及可溶性糖含量呈下降趋势,GN42中各指标的降幅比GN121更大,酸性磷酸酶活性、相对电导率和可溶性蛋白含量却有不同程度的增加。当恢复供磷3 d后,除相对电导率持续升高外,其余指标的变化均与贫磷胁迫下相反。除相对电导率外,同一条件下GN121的各项指标均比GN42大。3)结合二代和三代转录组测序,构建了大麦响应贫磷胁迫的转录本数据库,比较基因在不同磷水平下的表达量,在GN121和GN42中分别鉴定到6 182和5 270个差异表达基因,其中大部分基因参与了磷代谢途径,且这些基因在GN121中的表达量显著高于GN42。在根系和叶片中分别检测到6和7个磷转运蛋白,它们的表达模式在GN121和GN42之间差异较大。     

大麦不同氮利用效率品种筛选及GS2基因的表达分析

为探明大麦品种的不同氮利用效率差异及质体型谷氨酰胺合成酶基因的表达差异,以48份大麦品种为材料,并利用不同氮水平营养液水培8周,研究其在低氮(0.4 mmol·L~(-1))、中氮(2.0 mmol·L~(-1))及高氮(5.0 mmol·L~(-1))下根、茎、叶的相关性状,筛选氮高效利用和氮低效利用的大麦品种,并利用qRT-PCR对筛选到的大麦氮高效和氮低效品种的GS2基因表达特性进行分析。结果表明,中氮下,除根干重和根含氮量外,其余的大麦苗期根、茎、叶各生物性状在品种间差异极显著,根据不同氮处理下的48份大麦品种苗期性状以及氮利用效率,筛选到1个氮高效品种(Z0099001)和2个氮低效品种(ARr-91和甘啤7号)。3个氮处理水平下,氮高效品种GS2基因的相对表达量高于氮低效品种,并且氮高效品种和氮低效品种根、茎、叶中GS2基因的相对表达量也各不相同,其中,叶中最高,茎中次之,根中最低。低氮条件下,根茎叶中,Z0099001的GS2基因的相对表达量高于甘啤7号,ARr-91最低。中氮条件下,根、茎、叶中均表现为氮高效品种高于氮低效品种,但在根中差异不显著,茎和叶中差异显著。高氮条件下,3个品种在根中GS2基因的相对表达量较低;在茎和叶中,Z0099001的相对表达量显著高于ARr-91和甘啤7号,且Z0099001叶中GS2基因的相对表达量在所有性状中最高。本研究结果为进一步解析大麦氮高效利用率奠定了基础。     

89份大麦遗传多样性分析及其网斑病抗性位点相关SSR标记筛选

大麦网斑病是大麦(Hordeum vulgare)主要病害之一,由网斑病菌(Pyrenophora teres)引起.近年来网斑病在我国大麦产区发生并流行,网斑病之所以在我国各大麦产区发生并流行,主要是由于生产中缺乏抗网斑病品种.为分析大麦种质材料遗传多样性,筛选与大麦抗网斑病性状相关联的SSR标记,本研究利用70对品种间表现多态性的SSR标记对89个大麦品种(系)进行分析.结果显示,70个SSR标记共检测出302个等位变异,平均4.31个,变幅为2～8个;等位基因频率为0.141 2～0.916 7;基因多样性和遗传相似系数的变化范围分别是0.103 9～0.894 4和0.520～0.873;多态性信息含量(polymorphic informationcontent,PIC)为0.098 5～0.884 6,平均为0.537.群体遗传结构分析表明,供试大麦亲本材料可分为2个亚群,群体遗传相似系数变幅为0.635～0.895.品种美41/I和美43/I的遗传相似系数最高,为0.895.根据一般线性模型(general linear model,GLM)分析,发现5个与大麦抗网斑病相关的标记,解释率在7.2％～22.4％之间,标记Bmac29和Bmag0613关联达到极显著水平(P＜0.01),对表型变异的解释率为分别为10.7％和22.4％.本研究为大麦网斑病抗病育种提供了一定理论依据.