甜瓜自毒作用相关MYB转录因子的克隆和表达分析

根据甜瓜自毒作用相关MYB转录因子核心区序列设计引物,采用RACE技术获得MYB c DNA全长。生物信息学分析表明,该转录因子全长1 164 bp,包括174 bp的5′非翻译区,105 bp的3′非翻译区,885 bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,属于MYB类转录因子中R2R3-MYB类型,与黄瓜R2R3-MYB类转录因子的氨基酸序列的同源性达97.28%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在植株浸提液胁迫处理2 d时表达量最高,推测该转录因子可能参与了甜瓜自毒相关基因初期的诱导表达,使植株对自毒胁迫做出主动的系统性应答反应。     

菠萝AcHMGR基因的克隆与表达分析

以菠萝(Ananas comosus L.cv.Comte de Paris)果实为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(命名为AcHMGR)的c DNA及基因组DNA全长。AcHMGR的c DNA全长2 407 bp,其开放读码框长度为1 740 bp,编码579个氨基酸;其基因组DNA全长为4 115 bp,从起始密码子到终止密码子的长度为3 764 bp,含有4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR结果表明,对照的菠萝果实中,AcHMGR基因表达量在花后0 d最高,从花后30 d开始,其表达量急剧下降,之后维持在一个较低水平直到果实成熟。经20 mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(CPPU)处理后,显著提高了AcHMGR基因在花后30 d果实中的相对表达量,为同期对照的1.8倍;但其他时期的相对表达量与对照相比无明显差异。研究结果表明,AcHMGR基因在菠萝果实早期发育过程中表达量较高,CPPU处理提高了AcHMGR基因的相对表达量并显著提高果实的重量,说明CPPU处理后AcHMGR基因可能在促进果实重量的增加中起着重要作用。     

橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

茶树牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表达分析

以铁观音芽叶为材料,验证从茶树转录组数据库中筛选到的1条牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGDPS)的编码全长序列c DNA。该c DNA全长1 661 bp,含有1个1 137 bp完整的开放阅读框,命名为Cs GGDPS。该基因编码378个氨基酸,氨基酸序列具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域;序列分析显示,该c DNA与其他植物GGDPS高度保守,与三七(Panax notoginseng)的亲缘关系最近。Cs GGDPS属于不稳定、亲水蛋白,可能定位到叶绿体中,不存在跨膜结构,无信号肽,发生磷酸化的位点可能有20个;二级结构主要由α-螺旋构成,三级结构与拟南芥GGPPS11匹配度最高。实时荧光定量PCR结果表明,在茶树发育过程和不同叶位Cs GGDPS的表达量随芽叶成熟度的增加呈上升趋势,随着做青过程的进行,Cs GGDPS的表达量逐渐升高;Cs GGDPS在父本黄旦、母本铁观音和子一代金观音中均有表达,但表达量存在差异。     

芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表达分析

采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明:Mi NDPK1基因c DNA全长1 019 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。Mi NDPK1蛋白定位于细胞质,无信号肽和跨膜区域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点;与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%,与菠菜同源性最低为82%。Mi NDPK1在芒果各组织中均有表达,以叶片中表达最高,其次是花和果皮;在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高,此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果,推测芒果Mi NDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。     

卡特兰ChCHS1和ChDFR1基因的克隆及表达分析

以卡特兰紫色花品种‘粉女郎’（Cattleya hybrid‘Pink Lady’）为材料,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中分离得到了一个查尔酮合酶（chalcone synthase, CHS）和一个二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase, DFR）同源基因的cDNA全长,分别命名为ChCHS1和ChDFR1,GenBank登录号分别为KP171693和KP171694。序列分析结果发现：ChCHS1的cDNA全长1 508 bp ,编码394个氨基酸;ChDFR1基因的cDNA全长1 250 bp,编码350个氨基酸。同源性检索和生物信息学分析表明,这2个基因编码的蛋白都具有各自的功能位点和保守性特征多肽序列。氨基酸序列比对与系统进化树分析显示,ChCHS1、ChDFR1基因在兰科中与蕙兰、石斛兰关系最近,与百合科关系较近。相对实时荧光定量PCR结果表明,ChCHS1 和ChDFR1都在蕾期表达量最低,伴随花朵的开放,表达量逐渐上升,最终分别在花朵盛开期和接近开放时达到最高。     

巴西橡胶树一个新的法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法在橡胶树中获得一个新的法尼基焦磷酸合酶基因,命名为Hb FPS2。序列分析显示,Hb FPS2基因组序列长4 171 bp,由12个外显子和11个内含子组成,c DNA全长1 288 bp,包含1 029 bp的开放阅读框、105 bp的5′-UTR和154 bp的3′-UTR,编码342个氨基酸,推测分子量为39.6 ku,等电点为5.27。氨基酸序列比对显示,Hb FPS2具有FPS家族保守的5个结构域。进化分析结果表明,Hb FPS2和Hb FPS1亲缘关系最近,与大戟科的蓖麻、大戟、麻风树法尼基焦磷酸合酶聚为一个亚类。定量PCR结果表明,Hb FPS2在橡胶树根、树皮、叶、花和胶乳等组织中均有表达,在花和胶乳中表达量较高,在根中表达量最低;茉莉酸和乙烯处理均能提高Hb FPS2基因的表达量,处理9 h时基因表达量分别提高了36倍和8倍。结果为分析法尼基焦磷酸合酶基因表达特性及其在天然橡胶生物合成途径中的作用机制奠定基础。     

金鱼草花青素糖基转移酶基因的克隆与表达特性分析

以白苏子(Perilla frutescens)花青素糖基转移酶基因为探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从金鱼草(Antirrhinum majus L.)叶片中克隆到花青素糖基转移酶基因(Am GT1)的全长c DNA,并对其表达特性进行分析。结果表明:Am GT1全长892 bp,编码277个氨基酸;进化分析表明Am GT1的氨基酸序列与白苏子的同源性最高为79%,与其他花青素糖基转移酶蛋白的同源性在42%~62%之间,表明Am GT1是从金鱼草中克隆的新的花青素糖基转移酶基因。实时定量RT-PCR分析表明:该基因在金鱼草叶片中的表达量最高,根中的表达量最低;该基因虽然在红色、粉色、黄色、白色花朵中均有表达,但在红色花朵中的表达量最高,且存在一个从紧蕾期到松蕾期的跃变。     

甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

应用电子克隆技术,以烟草AAG59585序列为探针,获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)基因的全长cDNA,命名为ScTD。经RT-PCR扩增和验证,该基因序列与电子克隆结果一致性高达99%。序列分析结果表明:ScTD基因全长2 120 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,164~1 681 bp),编码505个氨基酸,该基因编码蛋白定位于微体,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构原件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达,其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明:该基因在甘蔗各组织中均有表达,且在根中的表达量最高。此外,该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高,约为对照组的43.16倍,其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯,分别为6.90倍和4.40倍,推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。     

花生油质蛋白基因的克隆与表达分析

油质蛋白作为贮藏蛋白的一种,特异性表达在油料种子中。本研究从花生中克隆得到3个Oleosin22基因,分别命名为AhOleosin22a,AhOleosin22b,AhOleosin22c。AhOleosin22a基因全长为630bp,编码210个氨基酸;AhOleosin22b基因全长为636bp,编码212个氨基酸;AhOleosin22c基因全长为582bp,编码194个氨基酸,均属于Oleosin蛋白质家族。通过荧光定量PCR对Oleosin22基因在花生中的表达模式进行分析。结果显示,AhOleosin22基因在种子中的表达量最高。本研究为阐明Oleosin22基因在花生油脂合成的生理生化机制中的功能奠定了理论基础,丰富了花生品质改良育种的基因资源。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

龙眼叶片PAL基因的克隆与表达研究

为获得龙眼PAL基因的序列，并研究该基因在转录水平的表达，采用反转录PCR获得PAL的保守序列，然后利用RACE法克隆PAL基因的3'cDNA和5'cDNA序列，再利用DNAMAN软件拼接获得PAL基因的cDNA全长序列。以actin基因作为内参进行实时荧光定量PCR，研究PAL基因在4个龙眼品种嫩叶中的表达差异。结果表明，克隆得到Dlpal基因的cDNA全长序列为2 532 bp，开放阅读框为2 101 bp，编码839个氨基酸，分子量为92.259 ku，等电点为7.38。BLAST比对结果显示，该序列与其它物种的PAL基因具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明，Dlpal基因在4个龙眼品种‘乌龙岭’、‘松风本’、‘立冬本’和‘石峡’的嫩叶间的表达量差异显著，其中在‘立冬本’中表达量最高，在松风本中表达量最低。初步证明PAL基因在不同品种的龙眼叶片中的表达量差异显著。     

橡胶树HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2的表达分析

植物营养储藏蛋白VSP2是HAD家族蛋白(haloalcanoic acid dehalogenase super family,HAD)的主要成员之一。该蛋白具有酸性磷酸化酶的功能,在橡胶树氮素储存和植物凝集素防御胁迫中发挥着重要的作用。在前期研究中,利用c DNA-AFLP获得了1条与橡胶树棒孢霉落叶病抗病性相关的差异表达片段EST-IAN-24,通过Blast比对分析,发现该基因片段与其他物种的VSP2基因具有较高同源性。采用PCR和RT-PCR技术,克隆获得了一个橡胶树VSP2基因的c DNA和基因组序列,并将该基因命名为Hb VSP2。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)975 bp,含有4个内含子和5个外显子,编码324个氨基酸,推测该蛋白的分子质量为30.01 ku,等电点为4.80。该基因蛋白是HAD家族蛋白中的酸性磷酸酶,具有DXDXT基序特征。q RT-PCR定量分析发现,受多主棒孢病菌侵染后,Hb VSP2基因在橡胶树抗、感品种中的表达量存在着明显的差异,抗病品种(IAN873)的表达量显著高于感病品种(PR107),且在接种12 h达到了峰值;此外,该基因在水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯的处理下均能诱导其表达,对茉莉酸甲酯的敏感性明显高于其他2个激素。本研究初步表明,Hb VSP2基因可能参与橡胶树与多主棒孢病菌的互作并且与抗病性相关。     

番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因CpTAT的分离与分析

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,3′非编码区232 bp,开放性阅读框1 266 bp,编码421个氨基酸。序列分析表明,该基因为谷草转氨酶超家族成员,催化活性位点为第253位的赖氨酸,编码蛋白与毛果杨、野草莓、桃、拟南芥和水稻的TAT蛋白同源性分别为83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。荧光定量分析表明,Cp TAT基因在根中的表达量最高,在茎和果实中的表达较低,在叶中的表达量最低。与对照相比,外源乙烯处理能诱导番木瓜果实中Cp TAT基因表达量升高,而1-MCP处理则抑制了该基因表达,在果实衰老期表达量升高,该基因可能在番木瓜果实成熟衰老中起作用。     

橡胶树HbGAIP-B基因的克隆与表达分析

DELLA是赤霉素信号传导途径中一类重要的阻遏蛋白。本研究通过RT-PCR技术,从橡胶树优良品种‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因(GenBank登录号为KT696440)。该基因全长cDNA序列2135bp,阅读框1905bp,编码634个氨基酸,其编码蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为69.89ku,理论等电点为5.50。HbGAIP-B氨基酸序列与麻疯树JcGAIP-B、蓖麻RcGAIP-B、拟南芥AtRGA、AtGAI、AtRGL1、AtRGL2和AtRGL3的相似性分别为82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%。进化树分析表明,HbGAIP-B与JcGAIP-B亲缘关系最近。定量PCR分析表明,HbGAIP-B的表达受割胶处理诱导下调。赤霉素和乙烯利处理4h显著上调HbGAIP-B的表达,茉莉酸甲酯处理4h小幅下调HbGAIP-B表达。     

向日葵查尔酮合酶HaCHS基因的克隆与逆境应答

为探讨查尔酮合成酶(CHS)基因在向日葵抗逆机制中的作用,在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上,从向日葵耐病品种龙食葵2号中克隆了1个CHS的c DNA序列,该基因开放阅读框为1 197bp,编码398个氨基酸残基,分子量为43.54k D,等电点为6.17,命名为Ha CHS(Gen Bank登录号为KR921882)。氨基酸序列分析显示,Ha CHS具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(C~(167),H~(306)和N~(339))和特征多肽标签序列GVLFGFGPGL。系统进化分析表明,Ha CHS与菊科植物的大丽菊、紫茎泽兰和黑心菊等的CHS蛋白有很高的同源性,氨基酸序列相似性在93%~94%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在向日葵花中表达量最高为19.96,其次是盘、叶、茎和种,在根中的表达量最低为0.02。Ha CHS基因表达受核盘菌、创伤、4℃低温和茉莉酸(JA)等因素调控,但对脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)处理的应答差异不显著。     

茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。     

磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)基因的克隆与表达分析

本研究从花生中分离得到2个PDAT基因,分别命名为AhPDAT1和AhPDAT2。AhPDAT1基因全长为2103bp,编码700个氨基酸;AhPDAT2基因全长为2046bp,编码681个氨基酸,均属PDATs蛋白家族。通过荧光定量PCR对PDAT基因的特性进行了分析。结果显示,AhPDAT1基因在种子中的表达量最高,AhPDAT2基因在花生下胚轴中的表达量最高。这两个基因对9类胁迫均有响应,但响应模式不同。本研究有助于阐明PDAT基因在花生油脂代谢途径中的功能,为花生育种提供新的基因资源。     

甘蓝型油菜固醇载体蛋白2基因BnSCP-2的克隆与表达

固醇载体蛋白2(SCP-2)是一类小分子碱性蛋白,参与细胞内脂质运输、脂肪酸代谢以及过氧化物酶体β-氧化等过程。利用同源序列设计引物进行PCR扩增,克隆得到甘蓝型油菜固醇载体蛋白2基因的c DNA序列,命名为BnSCP-2。BnSCP-2的开放阅读框长372bp,编码一个由123个氨基酸残基组成的蛋白质,预测的蛋白质相对分子质量为13.52kD,等电点为9.35。SCP-2蛋白氨基酸序列非常保守,系统进化分析表明BnSCP-2与拟南芥SCP-2同源性最高。荧光实时定量PCR结果表明BnSCP-2在检测的各个组织均有表达,其中花和花蕾中的表达量最高;赤霉素、细胞分裂素和脱落酸等可显著诱导幼苗中该基因的表达,推测该基因可能参与调控幼苗生长发育。     

橡胶树HbWRKY3的克隆及其响应逆境胁迫的表达分析

通过RACE技术扩增获得橡胶树HbWRKY3基因,并对该基因及其所编码氨基酸序列进行生物信息学分析和响应逆境胁迫的表达分析,结果表明：该基因含有2个WRKYGQK结构域和2个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅰ类;由4个外显子和3个内含子组成,DNA序列全长3 780 bp;开放阅读框长度为2 211 bp,编码由737个氨基酸组成的多肽。该基因定位于细胞核中,在橡胶树叶片、树皮、花、胶乳等不同组织中都有表达,以花中的表达水平最高。盐、PEG、茉莉酸、水杨酸等非生物胁迫均可诱导HbWRKY3的表达,但干旱、ABA、乙烯和低温胁迫的诱导较为明显。