超强表达可豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI）转化苹果的研究

通过农杆菌介导法将超强表达载体PECp中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入了苹果品种‘嘎拉’。GUS检测和Southern杂交结果证明CpTI基因已经整合进苹果基因组。     

超强表达豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)转化苹果的研究

 通过农杆菌介导法将超强表达载体PECp中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入了苹果品种‘ 嘎拉’。GUS检测和Southern 杂交结果证明CpTI基因已经整合进苹果基因组。     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

1-甲基环丙烯处理对苹果贮藏中可溶性蛋白的影响

采用SDS-PAGE技术,以5个苹果品种为试材,探究1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对采后果实中可溶性蛋白的影响。结果表明,对照果实在后熟衰老阶段出现了7个特异蛋白条带,分子量分别为97.2、38.3、37.0、28.7、27.2、19.6和18.6 kD。特异蛋白的变化存在品种间差异,37.0 kD蛋白仅在‘嘎拉’和‘秦冠’苹果中表达;28.7 kD蛋白含量在‘嘎拉’和‘秦冠’苹果中减少,但在其他品种中保持稳定;27.2 kD蛋白在‘嘎拉’苹果中没有表达;18.6 kD蛋白仅在‘新红星’、‘秦冠’和‘富士’苹果中表达。经500 nL·L^-11-MCP处理的果实中97.2、38.3、37.0、27.2、19.6、18.6 kD蛋白的积累被推迟或减少,而‘嘎拉’和‘秦冠’苹果中28.7 kD蛋白的降解被延缓。     

苹果转CpTI基因株系花粉特性研究

转基因植物的花粉特性研究是进行遗传改良和转基因生态风险评价的一项基础工作。对7~8年生转Cp TI基因‘嘎拉’苹果花粉特性进行了研究,结果表明:转基因苹果花粉在大小、形态和表面纹饰等方面与对照花粉没有明显差别;转基因苹果花粉中畸形花粉多;供试的13个株系中12个株系的花药中花粉量显著低于对照,6个株系的花粉离体萌发率显著降低;测定了3个转基因株系的花粉生活力,其中2个株系显著低于对照。转基因‘嘎拉’苹果花粉人工授粉至普通‘富士’苹果柱头上能正常萌发,但中后期花粉管伸长较慢,花粉管到达胚珠的时间比对照延后约8 h。花器不同发育阶段内源激素测定表明,转基因株系各时期GA3含量均低于对照,而ABA含量在花蕾期低于对照,在气球期和平展期高于对照。对花药和花粉发育过程显微观察发现,转基因株系花药的结构及其发育正常,而花粉囊壁绒毡层的延迟分解影响了花粉发育可能是其花粉数量少、育性低的原因。     

保存8~33年的苹果试管苗增殖能力与端粒长度分析

为分析苹果试管种质端粒长度与繁殖能力、衰老的关系,探索端粒长度与苹果试管种质离体保存年限的关系,对保存多年的不同继代次数的3个苹果品种试管苗进行了表型、增殖能力以及端粒长度的研究。结果表明:保存了8~33年的‘富士’、保存8~27年的‘金冠’和保存8~25年的‘嘎拉’苹果茎尖试管苗继代增殖能力大部分没有变化,表型未发生明显变化;3个品种不同继代次数30 d苗龄试管苗叶片端粒长度均差异不显著;继代73代苗龄分别为10、30、50和90 d的试管苗叶片端粒长度变化因品种而异,‘富士’‘嘎拉’差异不显著,‘金冠’50 d苗龄的最长,90 d苗龄的最短;继代71代苗龄30 d的‘金冠’试管苗茎段端粒长度显著高于叶片,茎段和愈伤组织、叶片和愈伤组织之间差异不显著,‘嘎拉’表现为愈伤组织>叶片>茎段。苹果试管苗端粒长度变化与其增殖能力、表型及同一继代周期内衰老程度的变化相吻合。     

‘烟富7’在老劣品种果园改造中的高接试验

为推进苹果优良新品种‘烟富7’在老劣品种果园改造中的快速推广应用,我们针对目前栽培中着色不好的‘富士’‘嘎拉’及‘藤牧一’进行多点高接试验,嫁接方法是单芽切腹接。对嫁接亲和性、生长发育、产量品质等进行调查。结果表明,‘烟富7’嫁接在各品种上的表现差异不显著,综合表现都达到较好水平。因此,3个品种高接母树‘富士’‘嘎拉’‘藤牧一’均适合高接‘烟富7’,该品种可以在苹果老劣品种改造中大面积推广应用,促进苹果品种结构进一步优化。     

新疆红肉苹果杂交二代2个功能型株系果实风味品质的评价

【目的】探讨杂交二代(F2)2个功能型苹果优株及对照品种‘嘎拉’的果实风味品质,旨在为新疆野苹果资源的利用保存及功能型苹果育种理论与技术提供基本资料。【方法】以2个功能型苹果优株‘红心7号’和‘红心9号’为试材,以栽培品种‘嘎拉’为对照,对果实的类黄酮组分、糖酸组分、挥发性成分等风味物质的组成和含量进行检测分析。【结果】‘红心7号’与‘红心9号’硬度、Ca、Fe、Zn和花青苷含量及抗氧化能力均显著或极显著高于‘嘎拉’;3个参试材料均以果糖和苹果酸含量最高,2个功能型苹果优株糖、酸总量均显著高于‘嘎拉’;‘红心9号’果实各类挥发性成分种类数和特征香气成分种类数最高,含量以‘嘎拉’最高,但‘红心7号’各类挥发性成分和特征香气成分的种类数及含量均最低;‘红心9号’与‘红心7号’类黄酮含量分别是‘嘎拉’的3.1倍和2.3倍,但‘红心9号’味感偏酸,而‘红心7号’味感甜酸适口,与‘嘎拉’基本一致。【结论】‘红心7号’硬脆多汁,甜酸适口,果实类黄酮、花青苷和Ca、Fe、Zn含量及抗氧化能力均显著或极显著高于‘嘎拉’。因此,从新疆红肉苹果杂交二代分离群体中能够选育出综合品质优良的功能型苹果新品系。     

草莓主栽品种再生和转化的研究

 建立草莓主栽品种高效、稳定的离体再生体系和遗传转化体系, 获得了转基因植株。‘弗吉尼亚’和‘森嘎拉’的叶片离体再生芽频率达到100 %。试管苗叶片与农杆菌菌株EHA105 共培养3 d。共培养后的叶片在附加卡那霉素40 mg/L 的再生培养基上选择培养4周后, 外植体再生出转化芽, 弗吉尼亚的转化芽再生频率可达6. 8 %。采用组织化学染色法对随机选取的10 个GUS 基因转化植株进行基因表达测定, 结果5 个植株强烈表达GUS 活性。转bar 基因植株在附加除草剂草丁膦10 mg/L 的培养基上能够正常分化, 在田间对草丁膦表现出强烈抗性。转基因植株开花、结果正常。     

不同抗性种质上褐斑病菌诱导的苹果几丁质酶基因表达特征分析

植物几丁质酶通过降解真菌细胞壁起到抵抗真菌病害的作用,是一种重要的病程相关蛋白。现以苹果品种‘富士’、‘秦冠’及其杂交后代为试材,采用荧光定量PCR的方法,研究接种苹果褐斑病对苹果几丁质酶基因MdChi表达的影响。结果表明:褐斑病菌诱导下MdChi在3份种质的叶片中均有表达,感病品种‘富士’叶片中MdChi基因表达量明显高于抗病品种‘秦冠’及二者杂交后代‘FQ-2’。侵染后24h时‘富士’叶片中的MdChi表达量明显上升,48h后表达量又迅速下降。而抗病品种‘秦冠’及抗病杂种‘FQ-2’中MdChi基因表达量在侵染后的96h内未有较大幅度变化,均保持在较低水平。     

农杆菌介导Ferritin基因转化苹果的研究

以皇家嘎拉苹果的叶片为转化受体,通过根癌农杆菌介导将铁结合蛋白(Ferritin)基因导入受体中,诱导获得了抗性芽.经PCR检测从抗Km植株中选择到4株阳性植株,进一步经PCR-Southern杂交证实外源基因已整合到4株苹果基因组中,RT-PCR检测表明,Ferritin基因在4株转基因植株中得到了表达.     

苹果新品种‘华硕’在我国14个产地的表现

2014—2015年连续2年调查了苹果新品种‘华硕’在河南等8省14个产地的果实经济性状、生长结果习性、成熟期、抗逆性。结果表明,‘华硕’在14个产地适应性良好,表现出结果早、产量高、抗病性强等特点。果实表现为果个大、外观艳丽、肉质细、货架期长。作为早中熟品种,可以在我国西南冷凉地区建立优质商品果生产基地,在苹果炭疽叶枯病发生严重的黄河故道地区可作为取代‘嘎拉’的品种,在西北黄土高原地区和环渤海湾地区可作为中熟品种或‘富士’的授粉品种推广发展。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

华东葡萄泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的抗白粉病特性分析

【目的】分析华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’的Ring型泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的转基因植株对葡萄白粉病的抗性,研究这2个基因的抗白粉病特性,为改良欧洲葡萄抗病性提供可用基因。【方法】利用同源克隆的方法获得中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的编码区序列(CDS);通过实时荧光定量PCR方法检测其在白粉菌诱导和水杨酸处理后的葡萄叶片中的表达;使用聚乙二醇(PEG)介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位;通过农杆菌介导法获得转基因‘无核白’和‘红地球’植株;经过苯胺蓝染色,利用血球计数板计数分析白粉菌在转基因植株叶片上的生长情况,鉴定转基因株系的抗病性。【结果】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3响应白粉菌和水杨酸处理,表达模式明显区别于感病对照‘赤霞珠’。中国野生华东葡萄‘白河-35-1’VpUIRP2蛋白定位在细胞质,VpUIRP3蛋白定位无特异性。通过农杆菌介导的遗传转化获得4个VpUIRP2的转基因‘红地球’株系和1个‘无核白’株系,转基因株系对白粉病表现出抗性。【结论】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2能增强葡萄对白粉病的抗性,可以作为抗病基因用于改良欧洲葡萄的抗病性。     

乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达

构建了乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S的表达载体pYF9616,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳中,得到了抗卡那霉素的GUS阳性转化植株。随机取3株GUS染色阳性的转基因苹果植株经PCR扩增及RT-PCR检测证实该基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,ELISA检测证明在苹果植株中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白基因。     

苹果种间杂种对苹果腐烂病感病性的遗传分析

【目的】为分析苹果实生树对苹果腐烂病抗病性的遗传规律,【方法】2010—2011年连续2 a用2个苹果腐烂病菌株对‘紫塞明珠’ב富士’的杂种实生树1 150株进行离体接种鉴定,采用次数分布分析法研究了苹果腐烂病抗病性遗传。【结果】结果表明,连续2 a接种2菌株主基因遗传率均在78.5%～85.5%。该实生群体对菌株03-8的感病性的变异由5个主基因位点分离所致,而对菌株xc56的感病性分离与4个主基因位点有关,且年份间表现稳定。【结论】离体枝条接种病原后,发病/不发病表现为质量性状遗传,发病对不发病为显性。感病的实生树接种后发病的病斑长度表现为多基因数量性状遗传。     

‘嘎拉’苹果小孢子来源纯合基因型植株叶片再生体系研究

【目的】建立‘嘎拉’苹果小孢子来源纯合基因型植株高效再生体系,探索一个简单有效的苹果纯合基因型株系叶片外植体诱导再生不定芽的方法。【方法】以‘嘎拉’苹果花药离体培养获得的纯合基因型株系离体叶片为外植体,进行再生培养,检测‘嘎拉’各纯合基因型株系的不定芽再生能力;通过优化植物生长调节剂、叶片预处理和培养方式,建立苹果纯合基因型植株高效再生体系。【结果】苹果纯合基因型株系中双单倍体株系DH2-10的再生率最高,四倍体纯系DH2-15次之,单倍体株系DH2-3再生率较低,三倍体纯系DH2-40在培养中难以再生。不同基因型适宜的激素质量浓度不同,相较于双单倍体株系,四倍体纯系DH2-15在较高细胞分裂素水平再生率较好。再生培养过程中,整叶带伤口的外植体预处理方式优于叶片切块接种的方式,接种苗龄40 d左右的叶片有更好的再生率。【结论】建立了苹果纯合基因型高频高效离体再生体系:双单倍体株系DH2-10在最适再生培养基MS+0.5 mg·L~(-1)IBA+5 mg·L~(-1)6-BA上培养,再生周期为23~35 d,再生系数为7.27,再生率达100%。四倍体纯合基因型株系DH2-15适宜在MS+0.5 mg·L~(-1)IBA+6 mg·L~(-1)6-BA培养基上进行再生培养,再生率为93.33%。建立的再生体系可用于纯合基因型株系的快速增殖和遗传转化。     

苹果MdNAC143的克隆及其在苹果愈伤组织的抗盐功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个NAC转录因子基因MdNAC143(序列号:MDP0000334047),其开放阅读框为924 bp,编码308个氨基酸,预测蛋白质的分子量为35.59 k D,等电点为6.32。结构域分析表明,MdNAC143蛋白N端含有保守的NAC结构域。酵母双杂交结果表明MdNAC143的全长及C端具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MdNAC143在苹果的各个组织均有表达,其中在叶片和花中表达相对较高;MdNAC143的表达明显受盐胁迫的诱导。将MdNAC143遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,进行抗盐表型鉴定后发现,MdNAC143在愈伤组织中过量表达后能明显提高对盐胁迫的抗性。     

不同苹果品种在贮藏过程中果实质构的变化

【目的】探讨不同苹果品种在贮藏过程中果实质地差异及其变化规律。【方法】以‘嘎拉’‘津轻’‘乔纳金’‘富士’为试材,通过TPA(texture profile analysis,质地剖面分析)测试和穿刺试验两种测试方法,测定4个不同苹果品种贮藏过程中质构参数,并对质构参数进行相关性分析。【结果】基于TPA测试和穿刺试验测试,4个不同苹果品种之间果实质地存在一定差异。0 d时,‘嘎拉’TPA果肉硬度、穿刺果皮硬度、果肉硬度、最大模量明显高于其他3个品种,‘富士’‘津轻’‘乔纳金’3个品种之间差异不明显。采后贮藏过程中,4个苹果品种的11个质构参数总体的变化趋势大体一致呈下降趋势,但变化规律也稍有差别。‘乔纳金’和‘嘎拉’TPA果肉硬度、咀嚼性、穿刺果皮硬度、最大模量、果肉硬度、果皮做功、果肉做功等质构指标在贮藏过程中下降最快,‘津轻’‘富士’下降最慢或变化不大。而回复性、内聚性、弹性、最大硬度时位移则变化较平稳。相关性分析表明,除最大硬度时位移外,果肉硬度、咀嚼性、回复性、弹性、内聚性、果皮硬度、最大模量、最大硬度时位移、果皮做功、果肉硬度、果肉做功之间呈显著相关性,大多呈正相关关系。【结论】不同苹果品种在贮藏过程中果实质地变化存在差异,TPA测试参数与穿刺测试参数之间大多存在显著正相关。TPA所测果肉硬度、咀嚼性、回复性及穿刺果皮硬度、最大模量、果肉硬度是评价苹果果实的重要质构参数。     

苹果采后热空气处理对表面伤口愈合的影响

 以‘嘎拉’和‘红富士’苹果为对象，研究热空气处理（38°C 4d）对苹果伤口愈合的影响。扫描电镜观察发现，38°C 4d热空气处理能使苹果表面的果蜡融化，从而封堵微小伤口，并使真菌菌丝体胶囊化而失活，阻止病原菌的入侵。与人工刺伤后立即接种病原菌相比较，苹果伤口在38°C或者20°C下处理 4d后再接种病原菌能显著提高伤口的抵抗能力，降低伤口处病害的发生和发展。与20°C处理相比，38°C热处理有利于‘红富士’苹果人工刺伤伤口的愈合，但是不利于‘嘎拉’的伤口愈合。