苹果愈伤组织超表达MdNAC029促进花青苷积累

以‘光辉’海棠(Malus spectabilis‘Guanghui’)与‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)杂交后代中分离出来的红肉苹果果实为试验材料,克隆得到1个NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子基因,命名为MdNAC029。该基因开放阅读框(ORF)为843 bp,编码含有280个氨基酸的蛋白。保守结构域分析显示,MdNAC029蛋白在N端包含1个保守的NAC结构域。基因表达分析显示该基因在红肉苹果果实中表达量较非红肉果实高。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdNAC029,其花青苷积累显著增加,表明MdNAC029在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含1个MdNAC029转录因子的结合位点。同时,烟草瞬时表达试验显示,MdNAC029能够激活MdMYB1基因的表达。由此推测,MdNAC029可能通过直接促进MdMYB1基因的表达,正向调节花青苷的积累。     

苹果MdRCD1基因的表达分析以及功能的初步鉴定

【目的】分离克隆苹果MdRCD1基因,分析其蛋白结构和逆境响应,并初步鉴定MdRCD1在苹果愈伤中的功能。【方法】同源克隆MdRCD1并测序,用DNAman和MEGA5相关软件分析MdRCD1氨基酸序列以及进化关系,不同逆境处理‘嘎拉’苹果组培苗,qRT-PCR分析MdRCD1在逆境条件下的表达量。农杆菌介导的遗传转化方法获得过量表达MdRCD1的转基因愈伤,不同盐浓度处理野生型和转基因愈伤,观察愈伤的长势,检测愈伤的鲜质量、脯氨酸和丙二醛含量,鉴定MdRCD1的初步功能。【结果】从‘嘎拉’苹果中克隆了MdRCD1(MDP0000234325)基因。该基因ORF为1 803 bp。通过进化树和蛋白同源性分析,表明苹果MdRCD1和中国白梨PbRCD1进化亲缘关系最近。在MdRCD1的N端有1个保守的WWE结构域,1个PARP催化中心,在C端有1个RST结构域。qRT-PCR实验表明MdRCD1在苹果各个组织器官中都有表达,在茎中的表达量高于其他组织;同时MdRCD1的表达受Na Cl、ABA、渗透胁迫等逆境胁迫的诱导。通过农杆菌侵染获得过量表达MdRCD1转基因苹果愈伤。盐胁迫处理条件下,过量表达MdRCD1的抗性明显提高。【结论】MdRCD1在进化过程中比较保守,苹果不同组织中都有表达,过量表达MdRCD1苹果愈伤的抗盐性得到提高。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定

利用生物信息学的方法,对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测,并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析,同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR,检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫(包括盐、低温、ABA、干旱)的响应,结果表明,MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外,通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能,MdCBL1过量表达明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。     

龙眼胚性愈伤组织AGO10基因克隆及其表达分析

【目的】探究龙眼胚性愈伤组织Argonaute10(AGO10)基因的特性与龙眼生长发育、激素响应及非生物胁迫响应之间的关系。【方法】根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,采用RT-PCR结合RACE技术,以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织cDNA为模板,进行龙眼胚性愈伤组织DlAGO10基因的克隆和生物信息学分析,同时利用qRTPCR技术分析DlAGO10基因在龙眼体胚发生过程中、不同组织部位中、对不同激素的响应以及非生物胁迫响应的表达情况。【结果】获得龙眼DlAGO10基因的c DNA全长序列(GeneBank登录号为MH708535),全长共3 859 bp,其中包含完整开放阅读框(ORF)3 003 bp,编码999个氨基酸。生物信息学分析表明,DlAGO10的保守结构域具有AGO的经典结构域PiWi结构,与甜橙和克莱门柚AGO10蛋白同源性较高。qPCR分析结果表明,在龙眼体胚发生过程中,DlAGO10在龙眼非胚性愈伤组织时期和子叶胚时期的表达量较高,在‘红核子’龙眼合子胚S5阶段的相对表达量最高;不同组织部位的表达情况为,DlAGO10在‘红核子’龙眼雌花中表达量最高,雄花次之,其他组织部位表达量均较低。植物激素和非生物胁迫处理下的表达分析表明,一定浓度的2,4-D、KT和水杨酸(SA)均可诱导DlAGO10上调表达,而茉莉酸甲酯(MeJA)即可上调也可下调;盐、渗透、干旱和脱落酸(ABA)胁迫均可上调DlAGO10的表达。【结论】DlAGO10可能参与龙眼体胚发生早期和晚期的转录调控过程,且可能参与生长素、细胞分裂素、SA和ABA的逆境胁迫信号转导途径,调控龙眼多种非生物胁迫应答过程。     

垂丝海棠MhMYB114-Like的克隆及其在苹果愈伤组织中的抗缺铁功能鉴定

从苹果砧木垂丝海棠(Malus halliana Koehne)中克隆得到了Mh MYB114-Like基因(序列号:LOC103405832)。该基因包含全长为602 bp的完整开放阅读框,编码200个氨基酸,蛋白质等电点为9.38。系统进化树分析表明,Mh MYB114-Like与野草莓该家族蛋白亲缘关系最近。分析Mh MYB114-Like的启动子区域发现包含干旱、光、生长素和黄化响应等顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,在缺铁胁迫下Mh MYB114-Like在垂丝海棠叶和根中表达水平显著上升,Mh MYB114-Like的表达明显受缺铁胁迫的诱导。将Mh MYB114-Like遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,通过测定相关生理指标进行抗性分析发现,过量表达Mh MYB114-Like可明显提高转基因愈伤组织对缺铁胁迫的抗性。结果表明Mh MYB114-Like可响应缺铁胁迫,在抵抗缺铁胁迫中具有重要作用。     

苹果MdNAC9的克隆及其调控黄酮醇合成功能的鉴定

为了探究红肉苹果黄酮醇合成机理,分析通路相关基因,从成熟期红肉苹果中克隆了1个NAC转录因子基因Md NAC9。通过Real-TimePCR、酵母单杂交和荧光素酶报告试验,探究Md NAC9与苹果黄酮醇积累的相关性。结果表明,在苹果果实和过表达Md NAC9的愈伤组织(OENAC9)中Md NAC9表达量变化与黄酮醇合成相关基因Md FLS表达量变化趋势一致。酵母单杂交试验证明,Md NAC9具有转录激活功能,能够特异结合Md FLS基因启动子。荧光素酶报告试验显示,Md NAC9对Md FLS的启动子有激活作用,促进Md FLS的表达。Md NAC9可能通过激活Md FLS促进苹果黄酮醇积累。     

植物Gly-RLK基因家族鉴定及其在苹果中的表达分析

类受体激酶（receptor like kinase，RLK）在植物生长发育和环境适应中起重要作用。前期研究发现苹果（Malus  domestica）中存在一类具有Glyco_18胞外结构域（SM000636或SM000704）的RLK，命名为Glyco_18-RLK（Gly-RLK）。本试验中以Glyco_18和Pkinase（SM000220）保守域全蛋白序列为种子序列，对53种被子植物基因组中的Gly-RLK进行鉴定，并分析其进化特征；明确苹果Gly-RLK（MdGly-RLK）的理化性状、亚细胞定位，基因在染色体上的分布、启动子区域的顺式作用元件和表达模式。结果表明，仅19种植物中存在Gly-RLK，家族成员数介于1 ~ 20，单子叶植物中均未发现该家族成员。根据进化分析将其分为8个亚组，亚组Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ分布基因数较多。共发现6个MdGly-RLK，其编码的氨基酸序列大小、分子量和等电点分别介于451 ~ 776、50.99 ~ 87.33 kD和5.95 ~ 8.21，主要位于质膜，4个为串联重复。MdGly-RLK在苹果各组织和品种间存在不同的表达模式；接种苹果腐烂病菌（Valsa mali）后，6个MdGly-RLK均差异表达，MdGly-RLK6（MD15G1156900）可上调至对照的16.33倍。综上，Gly-RLK仅在部分双子叶植物中存在，家族成员的扩增速度较快。MdGly-RLK响应苹果生长发育和黑腐皮壳菌信号，MdGly-RLK6可作为苹果抗腐烂病研究的候选基因。     

苹果L-LEC-RLK基因家族鉴定及响应病原真菌信号的表达分析

以L型类凝集素(Lectin-LegB;Pfam:PF00139)和激酶(Pkinase;Pfam:PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,鉴定了苹果(Malus×domestica Borkh.)L型类凝集素类受体激酶(L-LectinReceptor-like kinase,L-LEC-RLK)家族成员,并对其理化性状、进化特征、亚细胞定位、染色体位置和表达模式进行分析。通过鉴定,共获得41个成员,其氨基酸序列大小介于423～1 291 aa,分子量介于47.12～143.27 kD,等电点介于5.50～8.91,其中28个成员位于质膜。根据进化分析将拟南芥、水稻、马铃薯、杨树和苹果等5个物种的L-LEC-RLKs分为8个亚组,苹果L-LEC-RLKs分布于亚组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ。染色体位置分析表明苹果L-LEC-RLKs存在多个串联重复。该家族成员在不同组织中存在多样化的表达模式。27个成员在苹果接种腐烂病菌(Valsa mali,Vm)或斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype,AAAP)后存在差异表达。其中,MD15G1226500和MD14G1055200的表达量在两种病害发生后都发生了显著的差异。以上差异基因可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。     

苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2调控花青苷积累的研究

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆蔗糖转运蛋白基因MdSUT2(序列号:MDP0000277235),该基因包含1 704 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,蛋白大小为56 kD。构建MdSUT2表达载体并利用农杆菌介导法侵染拟南芥,半定量RT-PCR证明Md SUT2在拟南芥中异源表达。构建瞬时表达载体,‘红星’苹果进行Md SUT2瞬时表达,其花青苷含量增多,而沉默该基因花青苷含量明显降低。     

苹果细胞分裂素O–糖基转移酶基因MdZOG1的分离与功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果细胞分裂素O–糖基转移酶基因MdZOG1。MdZOG1的开放阅读框(ORF)长度为762bp,编码含有253个氨基酸的蛋白。系统进化树分析显示,MdZOG1与PbZOG1亲缘关系最近。基因表达分析显示MdZOG1主要在苹果根和茎中表达,在花和果实中的表达量较低。通过农杆菌介导的遗传转化获得转MdZOG1拟南芥和烟草。干旱处理试验结果显示:超量表达MdZOG1显著提高拟南芥和烟草植株的抗旱能力,表明苹果细胞分裂素O–糖基转移酶在植物抗旱胁迫中发挥重要作用。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析，结果表明，CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp，编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示，CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示，CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料，qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达，且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明，Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达，并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明，CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。