超强表达可豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI）转化苹果的研究

通过农杆菌介导法将超强表达载体PECp中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入了苹果品种‘嘎拉’。GUS检测和Southern杂交结果证明CpTI基因已经整合进苹果基因组。     

几种主要抗虫基因及其在蔬菜育种中的应用

综述了Bt毒蛋白基因，CpTI基因等几种主要抗虫基因的抗虫原理，分类与抗虫谱，及其在蔬菜育种上的应用。     

转甘蔗抗虫基因CpTI的RT-PCR检测

利用已修饰的CpTI基因进行转基因检测,根据修饰后的目的基因片段序列对两个甘蔗品种（P44和福农94-0403）的转基因甘蔗进行RT-PCR检测研究,结果在被检测的10株甘蔗中验证了3株已转入植株中,RT-PCR检测到的20、25、26号植株均呈阳性,证明被修饰的sck基因已成功转入甘蔗。     

苹果WUSCHEL-related homeobox(WOX)家族基因的鉴定与分析

利用生物信息学方法和苹果基因组数据库,鉴定并分析了12个苹果WUSCHEL-related homeobox(WOX)家族基因。系统进化树分析表明,苹果WOX家族和拟南芥WOX家族可被分为现代分支(WUS分支)、中间分支和祖先分支;苹果WOX家族成员均含有1个motif-1,不同分支的成员含有其分支特异的motif;基因结构分析显示,苹果WOX家族基因含有2～4个外显子,染色体定位发现11个基因分别定位在苹果的7条染色体上,1个基因无准确定位。基因表达模式分析表明,12个基因在苹果各组织中均有表达,且在果实中的表达量较高;密码子偏好性分析显示,苹果WOX家族基因的偏好性较弱。     

60个苹果新品种S基因型鉴定

绝大多数苹果品种具有自交不亲和的特性，生产中需要搭配授粉树完成异花授粉。在苹果中已经分离鉴定了50多个S-RNase基因，对于一些新选育品种的S基因型至今未得到鉴定。利用S-RNase基因特异性PCR分析的方法鉴定了60份苹果新种质资源的S基因型，在60份苹果种质资源中，有56份品种的S基因型是首次鉴定到，并首次鉴定到了一个红肉苹果品种‘红色之爱’的S基因型，其S基因型是S19S？。新品种S基因型的鉴定能够为苹果育种亲本的选择及授粉树的合理搭配提供依据。     

苹果TIFY家族基因鉴定及其在虫害胁迫下的表达分析

利用生物信息学方法在苹果全基因组中鉴定了TIFY转录因子家族基因,对基因结构、蛋白保守基序和进化关系进行了分析,同时基于新疆野苹果(Malus sieversii)转录组数据分析,明确了苹果TIFY家族基因在虫害胁迫条件下的差异表达情况。共鉴定到了16个苹果TIFY基因,其蛋白质大小介于209~449 aa之间。16个TIFY基因分布于苹果8条染色体中,所有的MdTIFY蛋白都具有保守的TIFY结构域。其中8个苹果MdTIFY与新疆野苹果转录组测序拼接转录本对应,这些基因均含有保守的TIFY功能域,多物种进化分析表明该类蛋白可聚类成7个组。7个TIFY基因的表达量在不同处理间表现出显著差异,虫害侵染后,抗虫株系中MsTIFY10B-a表达量升高34倍,MsTIFY9-c上升5.2倍。同时抗虫株系在自然条件下茉莉酸—异亮氨酸含量显著高于敏感株系。新疆野苹果中重要抗虫响应基因MsTIFY10B-a和MsTIFY9-c位于预测关联网络节点中心位置,使它们在调节植物对生物胁迫的响应中发挥重要作用。     

乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达

构建了乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S的表达载体pYF9616,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳中,得到了抗卡那霉素的GUS阳性转化植株。随机取3株GUS染色阳性的转基因苹果植株经PCR扩增及RT-PCR检测证实该基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,ELISA检测证明在苹果植株中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白基因。     

不同苹果品种抗苹果绵蚜的漆酶基因表达模式及其原核表达载体筛选

【目的】明确不同苹果品种漆酶基因在抗苹果绵蚜过程中的差异表达模式，探索原核表达苹果漆酶蛋白的方法与条件。【方法】基于转录组测序分析抗蚜品种新红星(Starkrimson)、小国光(Ralls Genet)与感蚜品种红富士(Red Fuji)3个苹果品种被苹果绵蚜为害0 h、12 h、5 d后漆酶基因的表达模式，筛选抗蚜候选漆酶基因；选择pET-28a(+)、pET-32a(+)、pGEX-TEV、pHAT2 4种载体，对4个漆酶基因MdLac23、MdLac6、MdLac7、MdLac2进行原核表达，对表达产物进行Western-Blot验证，镍柱亲和层析纯化，以ABTS为底物分析其酶活性。【结果】与对照相比，不同苹果品种被害12 h、5 d后，苹果枝条中漆酶差异表达基因数量为27个。不同苹果品种的漆酶基因表达模式存在差异，抗蚜品种新红星及小国光漆酶差异表达基因上调表达居多，感蚜品种红富士下调表达居多，新红星12个基因上调表达，无下调表达基因；小国光9个基因上调表达，3个基因下调表达；红富士10个基因下调表达，4个基因上调表达。其中新红星特有的上调表达基因数量为6个，小国光特有的上调表...     

世界苹果和苹果属植物基因中心的研究初报

根据植物分类学、酶学和核学的研究,作者确认塞威士苹果Malus sieversii.( Ldb.)Roem。是苹果的原生种,它不起源于高加索而起源于中亚细亚,一直延伸到东部与我国新疆接壤的苏联地区阿拉木图。 论文郑重提出世界苹果基因中心应当包括与苏联阿拉木图接壤的我国新疆的伊犁地区。该地区自古迄今长有九千公顷以上的塞威士苹果,而高加索的野生苹果属东方苹果Malus Orientalis Uglitzk,不是塞威士苹果。 在苹果属植物的基因中心问题上,中国的四川和云南的西部,地质学家称为川滇古陆的走廊地带是苹果属植物的大基因中心,就世界范围而言该地苹果属植物的野生种种类最多,但它不是世界苹果属植物唯一的发祥地,因为亚洲的东部和西部、欧洲、北美都长有苹果属的特有种。虽然各地苹果属植物的种类没有川滇古陆多,但所有的种类在不同的地区,同一纬向地带形成了世界苹果属植物的多基因中心。 基于细胞地理学和生态地理学的研究可以看出,世界苹果属植物种类的传播却有从亚洲到欧洲、日本和北美的趋势。     

苹果功能基因组数据库的构建与使用

 苹果功能基因组数据库是在苹果全基因组分析及注解基础上,对苹果基因组进行广泛的基因家族分类及系统进化分析;数据库还包含广泛的基因信息,包括CDS及蛋白质序列、染色体定位、基因结构、GO分类、蛋白质结构域分析、Interpro分类、表达谱、microRNA及相关文献等;此外,数据库还提供用户交互平台,研究人员可提交基因信息及相关文献等参与苹果基因注释。数据库登录地址是：http：//www. applegene. org/或http：//gfdb. sdau. edu. cn/。     

根癌农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入苹果主栽品种

研究建立起一套简单、高效的苹果遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导的叶圆片转化法将高效启动的豇豆胰蛋白抑制剂基因（ＣｐＴｌ）转入富士、齐纳金、王林、嘎拉等苹果主栽品种中,经卡那霉素抗性、ＰＣＲ、点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交检测证明了４个品种均获得转化再生植株,现已移栽成活。     

苹果转CpTI基因株系花粉特性研究

转基因植物的花粉特性研究是进行遗传改良和转基因生态风险评价的一项基础工作。对7~8年生转Cp TI基因‘嘎拉’苹果花粉特性进行了研究,结果表明:转基因苹果花粉在大小、形态和表面纹饰等方面与对照花粉没有明显差别;转基因苹果花粉中畸形花粉多;供试的13个株系中12个株系的花药中花粉量显著低于对照,6个株系的花粉离体萌发率显著降低;测定了3个转基因株系的花粉生活力,其中2个株系显著低于对照。转基因‘嘎拉’苹果花粉人工授粉至普通‘富士’苹果柱头上能正常萌发,但中后期花粉管伸长较慢,花粉管到达胚珠的时间比对照延后约8 h。花器不同发育阶段内源激素测定表明,转基因株系各时期GA3含量均低于对照,而ABA含量在花蕾期低于对照,在气球期和平展期高于对照。对花药和花粉发育过程显微观察发现,转基因株系花药的结构及其发育正常,而花粉囊壁绒毡层的延迟分解影响了花粉发育可能是其花粉数量少、育性低的原因。     

大白菜转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因获得抗虫植株

 以大白菜3 d 苗龄带柄子叶为外植体, 经根癌农杆菌(Agrobacterium tumef aciens) 介导, 将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck) 导入大白菜自交系‘GP-11’和杂交种‘中白4号’, 并获得了卡那霉素抗性植株。PCR 检测和Southern blot 杂交证实, sck 基因已整合进大白菜基因组中; 豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明, 大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性, 对照未转化植株抑制活性很低。室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明, 转基因植株对菜青虫(Pieris rapae L. ) 具有一定抗性。     

苹果光敏色素作用因子基因PIF 的克隆和分析

 以短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得一个光敏色素作用因子（PIF）基因,命名为MdPIF。该基因编码区共2 142 bp,推测其编码713个氨基酸。氨基酸序列分析显示,在其C端具有保守氨基酸结构域bHLH,N端具有光敏色素结合域APB,与其它植物光敏色素结合因子有很高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,在花后20 ~ 110 d,MdPIF在短枝型和非短枝型苹果枝条均能表达,同一生长时期,短枝型苹果枝条的表达量显著低于非短枝型,说明苹果短枝性状可能与MdPIF的差异表达有关。MdPIF在叶片、枝条、花瓣、果实和芽中均能表达,在不同器官中的表达量存在明显差异,在枝条中相对表达量最高,推测其可能主要调控苹果枝条的伸长。     

基于ITS和matK序列探讨新疆野苹果与中国苹果的系统演化关系

 以新疆地区不同居群的52份新疆野苹果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem.]、9份中国苹果品种（Malus × domestica subsp. chinensis Li.）、1份森林苹果（M. sylvestris Miller）种质为试材,进行核糖体DNA内转录间隔区（ribosomal DNA internal transcribed spacers,ITS）和叶绿体成熟酶K（matK）基因的测序分析。从GenBank中获取了11个苹果栽培品种、14个塞威士苹果、26个苹果属其它种及1个外类群欧洲梨（Pyrus communis）的ITS及matK序列。利用MEGA（ver. 4.0）计算不同序列间的碱基组成频率、简约信息位点数、转换/颠换比率、序列间成对距离,以最大简约法与邻接法进行系统发育分析。结果表明,采集的“新疆野苹果”与“中国苹果”的ITS序列长度在589 ~ 594 bp,含有148个简约信息位点,转换/颠换比率（R）为1.029;MatK序列长度为1 451 ~ 1 461 bp,没有复制子Ⅱ序列,含有16个简约信息位点,转换/颠换为1.442。ITS分析将中国苹果、新疆野苹果（来自中国新疆）和塞威士苹果（来自GenBank）聚类于一个大的发育枝内,新疆野苹果5个居群的系统演化按新源、巩留、霍城和塔城的先后次序发生。MatK序列的系统发育分析将中国苹果和新疆野苹果聚类在一个大的发育枝内,但自展支持率低。由此说明,中国苹果由新疆野苹果驯化而来。matK不适于栽培苹果种内的系统发育分析。     

Genome-wide analysis of antioxidant enzyme gene families involved in drought and low-temperature responses in Apple (Malus domestica)

Antioxidant enzymes were well-known for reactive oxygen scavenging and protecting cells from oxidative damage in multiple biotic and abiotic stresses. Aimed to overview of antioxidant enzyme gene families and screen for drought and low-temperature response members, the whole apple antioxidant enzyme genes in apple genome were studied. Out of 73candidates in seven antioxidant enzyme gene families among the entire apple genome, a total of 49 genes were identified, showed more antioxidant enzyme gene members than those in other plant species. A phylogenetic tree based on predicted functional domains and motifs of apple and Arabidopsis antioxidant enzymes revealed 19 putative drought or low-temperature response genes, and 9 out 19 genes belong to five families responded to both drought and low-temperature stresses. Subsequently, cis-elements in those nine antioxidant enzyme gene promoters were examined and abundant elements involved in multiple hormone regulation and abiotic stresses response, including drought and low-temperature were found. The tissue expression specificity for those nine members in eight kinds of tissues was also examined. Screening and identifying both drought and low-temperature response genes provide useful information to understand gene functions and promote application of antioxidant enzyme genes in apple abiotic resistance breeding.     

农杆菌介导Ferritin基因转化苹果的研究

以皇家嘎拉苹果的叶片为转化受体,通过根癌农杆菌介导将铁结合蛋白(Ferritin)基因导入受体中,诱导获得了抗性芽.经PCR检测从抗Km植株中选择到4株阳性植株,进一步经PCR-Southern杂交证实外源基因已整合到4株苹果基因组中,RT-PCR检测表明,Ferritin基因在4株转基因植株中得到了表达.     

苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2调控花青苷积累的研究

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆蔗糖转运蛋白基因MdSUT2(序列号:MDP0000277235),该基因包含1 704 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,蛋白大小为56 kD。构建MdSUT2表达载体并利用农杆菌介导法侵染拟南芥,半定量RT-PCR证明Md SUT2在拟南芥中异源表达。构建瞬时表达载体,‘红星’苹果进行Md SUT2瞬时表达,其花青苷含量增多,而沉默该基因花青苷含量明显降低。