沙田柚遗传转化的探讨

采用含ｎｏｓ基因和人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因ＡＰ－Ｄ基因的根癌农杆菌对沙田柚外植体进行转基因研究,与根癌农杆菌共培养产生的芽,苗经Ｋｍ敏感性筛选,获得了若干转基因植株,并对这些植株进行了报告基因ｎｏｓ表达的电泳检测,同位素标记、ＡＰ－Ｄ基因为探针的点印迹杂交,外源ＡＰ－Ｄ基因的ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交。结果显示,报告基因ｎｏｓ、抗菌肽Ｄ基因已转入沙田柚植株细胞中。     

Ri质粒介导TMV和CMV外壳蛋白基因转化甜椒研究

利用发根农杆菌（Ａｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）的Ｒｉ质粒介导的二元载体,将ＰＢＴＣ－８质粒上的ＴＭＶ－ｃｐ和ＣＭＶ－ｃｐ基因导入甜椒中,用共培养的方法,诱导愈伤组织,经卡那霉素的抗性筛选,进一步的培养获得再生植株,经ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ的检测呈阳性反应,转化植株田间人工接种为抗性,证明ＴＭＶ－ｃｐ和ＣＭＶ－ｃｐ基因导入甜椒植株并已表达。     

提高苹果基因转化效率的研究

采用根瘤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）强株系ＥＨＡ１０５（ｐ３５ｓＧＵＳ－ｉｎｔｒｏｎ）研究了影响‘皇家嘎拉’苹果（Ｍａｉｎｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）外植体的β-葡萄糖醛酸酶（ＧＵＳ）基因的瞬时、稳定表达水平和转基因植株的再生。证明在培养基生长素（ＩＢＡ、ＮＡＡ）存在的条件下,外植体的ＧＵＳ基因的瞬时表达水平提高了３－４倍,而共培养两周后稳定表达水平提高２倍以上,产生９．８个ＧＵＳ愈伤组织表达区域。白化处理促进外植体的基因转化,白化处理的新梢顶端第一节间外植体ＧＵＳ表达区域比常用的叶片外植体高４倍。在生长素存在的条件下 ２％外植体获得了转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ＢｌｏｔＤＮＡ杂交和组织化学染色分析证明ＧＵＳ基因已整合到苹果的染色体上,并得以表达。     

提高苹果基因转化效率的研究

采用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）强株系ＥＨＡ１０５（ｐ３５ｓＧＵＳ－ｉｎｔｒｏｎ）研究了影响‘皇家嘎拉’苹果（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）外植体的β－葡萄糖醛酸酶（ＧＵＳ）基因的瞬时、稳定表达水科和转基因植株的再生。证明在培养基生长素（ＩＢＡ、ＮＡＡ）存在的条件下，外植体的ＧＵＳ基因的瞬时表达水平提高了３～４倍，而共培养两周后稳定表达水平提高２     

黄瓜Rubisco 活化酶基因CsRCA 表达载体构建与遗传转化

 核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是光合碳循环中的关键酶,为了探明其在植物体内的活化机制,用农杆菌介导法将Rubisco活化酶（RCA）基因CsRCA导入黄瓜,分别用PCR、real-time PCR和Western杂交法进行分子检测,分析转基因植株的表达量。酶切鉴定结果显示,CsRCA正向插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,成功构建CsRCA的正义表达载体。将pCAMBIA1301-CsRCA导入黄瓜自交系‘08-1’,获得7株转基因植株,拷贝数均为2（非转基因植株的拷贝数为1）,转化率约为3.5%。表达分析结果表明,7株T0代转基因植株叶片的CsRCA mRNA表达量为野生型（WT）的1 ~ 1.98倍,在蛋白水平的表达信号显著强于WT。T1代转基因植株的叶片叶绿素和类胡萝卜素含量、光合速率（P_n）及可溶性糖和淀粉含量均显著高于WT。研究结果表明,利用农杆菌介导法获得了稳定遗传的黄瓜CsRCA转基因植株,CsRCA过量表达能显著提高黄瓜叶片的P_n,增加干物质积累。     

湖北海棠二价融合表达载体MhT2AC的构建及转化烟草耐盐性分析

 利用口蹄疫病毒2A序列将湖北海棠MhTGA2转录因子和几丁质酶基因（Mhchitl）两个抗病相关基因融合在同一个开放阅读框下，构建二价融合植物双元表达载体，命名为MhT2AC。将该载体转化烟草，获得了8个转基因株系，MhTGA2基因和Mhchitl基因在烟草中共表达，并且转基因株系中NtSOD、NtAPX和NtPPO等抗逆基因的表达量均加强；转基因烟草T₁代植株抗盐性增强。     

黄河蜜甜瓜CMV CP基因转化及其抗病性鉴定

利用整合有CMVCP基因及NPT-II基因的改建质粒pBim438,以农杆菌为载体,对黄河蜜甜瓜子叶进行转化,以75mg/L卡那霉素筛选转化体,获得了完整的转基因植株。Southern杂交证明转化植株整合了CMVCP基因,Western杂交证明转基因获得了表达。温室CMV攻毒试验及病毒含量测定表明,转基因甜瓜对CMV的侵染表达了较高的抗病性,能够推迟系统症状显症发生,减轻病害发生程度,转基因植株体内病毒含量低于对照。转基因植株抗病性存在差异,筛选出的2个抗性株系中,TM0-1抗性高于TM0-2。     

异戊烯基转移酶基因导入番茄及转基因植株再生

通过根癌农杆菌（Ａgrobacteriens）介导,利用特异启动子Ｐsag12与异戊烯基转移酶（Ｉsopenyl transferase,ipt）基因构建的嵌合基因Ｐsag12－ipt对５个番茄品种进行遗传转化,结果共获得来自３１个不同外植体的４４株转化再生植株。感染子叶的分化再生及转化植株田间生长正常。对其中部分转化再生植株进行ＰＣＲ检测证明为转基因植株,并且在田间表现出生长旺盛及抗叶片衰老的特性。     

西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

以郑州地区西瓜花叶病病叶分离物──西瓜花叶病毒２号（２－ＷＭＶ－）为毒源，从繁殖寄主西葫芦病叶中分离、鉴定了病毒。以病毒基因组ＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ，通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ），从ｃＤＮＡ中扩增和克隆了病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，其中包括３’端非编码区，完成了全部核苷酸序列分析。ＣＰ基因全长１０９９个苷耷酸，其中编码区长９０３个核苷酸，编码３０１个氨基酸，３’端非编码区长１９６个核苷酸。Ｚ－ＷＭＶ－２ＣＰ基因的编码区比Ａ－ＷＭＶ－２，Ｕ－ＷＭＶ－２两株系的ＣＰ基因编码区分别长出６０个核耷酸，多编码２０个氨基酸。与两个株系相比，编码区的核昔酸序列同源性分别为８８．５％和８７．０％，氨基酸序列同源性分别为９０．０％和８８．７％，３，端非编码区的同源性分别为６８．３％和７１．８％。若不考虑Ｚ－ＷＭＶ－２多出的６０个核苷酸及２０个氨基酸，则上述同源性依次为９５．４％、９３．７％、９６．４％、９５．０％、８８．８％和９３．４％。构建了含ＷＭＶ－２ＣＰ基因的大肠杆菌表达载体，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表达出了与天然病毒外壳蛋白分子量相同的蛋白。     

西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

以郑州地区西瓜花叶病病叶分离物－西瓜花叶病毒２号（２－ＷＭＶ－２）为毒源，从繁殖寄主西葫芦病叶中分离，鉴定了病毒，以病毒基因组ＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ，通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ），从ｃＤＮＡ中扩增和克隆了病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，其中包括３’端非编码区，完成了全部核苷酸序列分析，ＣＰ基因全长１０９９个核苷酸，其中编码区长９０３个核苷酸，编码３０１个氨基酸，３’端非编码区长１９６个核苷酸。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤–2’白藜芦醇含量高，并抗白粉病。以此为材料，利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因 VqSTS12 和 VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法进行遗传转化，分别获得 7 个 VqSTS12 和 5 个 VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量 PCR 分析发现，与野生型植株相比，转基因植株中芪合酶基因 STS 与下游白藜芦醇糖基转移酶基因 RSGT 表达量升高，与 STS 有底物竞争关系的查尔酮合酶基因 CHS 表达量降低。STS 的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现，转基因植株对白粉菌的敏感性降低，发病较晚，病情较轻，在转基因植株上部分孢子萌发受抑制，菌丝发育迟缓。转基因植株中 VqSTS12 和 VqSTS25 受白粉菌诱导表达：在接菌后 1 ~ 3 d 内表达量显著升高，随后略有下降，在 6 ~ 7 d 表达量再次上升。同时高效液相色谱（HPLC）检测到 STS 的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄拥有的 VqSTS12 和VqSTS25 及其表达的芪类物质具有抑制白粉菌的作用。     

茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析

以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体PYL156为工具,采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片,通过表型比较、TRV病毒分子检测和荧光定量PCR技术分析,探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子TRV-VIGS沉默体系的影响。结果表明,昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时,接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显,侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低;早春日光温室和秋季日光温室条件下,侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为200 bp左右时目的基因的沉默效果最好;侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑,而接种6周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证,结果表明显著抑制了SmIAA19的表达,其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低,表明SmIAA19是1个与生长素代谢途径相关的基因。     

大蒜花叶病原病毒的鉴定和茎尖脱毒效果

用洋葱黄矮病毒（ＯＹＤＶ）等９种酶标抗体，以常规酶联夹心法检测国内外５７份大蒜品种带病毒状况，同时，以诱捕修饰免疫电镜技术复核酶联法进行检测，结果表明，被检的５７份大蒜品种带有：洋葱黄矮病毒，韭葱黄条病毒（ＬＹＳＶ），亚实基隆葱潜隐病毒（ＳＬＶ），马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ），马铃薯Ａ病毒（ＰＶＡ），马铃薯Ｓ病毒（ＰＶＳ），马铃薯Ｍ病毒（ＰＶＭ），康乃馨潜隐病毒（ＣＬＶ）和烟草花叶病毒（ＴＭＶ）等９种病毒。 诱捕修饰免疫电镜图象表明，用上述９种病毒包被的电镜载网诱捕到大量的同源病毒粒子，这些病毒粒子又分别被同源抗体分子修饰，形成连续完整的抗体分子外套。用洋葱黄矮病毒等９种酶标抗体检测茎尖组织培养再生的８０株大蒜试管苗看出，完全脱掉９种病毒的试管苗占３０％，完全未脱掉病毒、带９种病毒的试管苗占５％其余的试管苗都程度不同地脱掉了所带的几种病毒。     

超量表达BoFLC3、AtFT 对芥菜开花期和抗寒性的影响

 将来自甘蓝的BoFLC3 基因和拟南芥的AtFT 基因在芥菜中单独或共同表达发现,BoFLC3超量表达后,无论是长日照还是短日照条件下,转基因芥菜植株开花时间均明显延后;BoFLC3 超量表达植株低温春化处理后,相对于未春化处理的转基因植株出现花期提前现象,但仍晚于非转基因对照植株;AtFT 基因超量表达植株开花时间比非转基因对照植株大幅度提前。BoFLC3 植株与AtFT 植株杂交获得的BoFLC3 和AtFT 共表达植株开花时间与非转基因对照基本接近,显示BoFLC3 和AtFT 基因超表达对植物开花时间的影响效应可以相互抵消。同时,超量表达BoFLC3 基因的芥菜植株抗寒性大幅度提高,而AtFT基因的超量表达不影响植株抗寒性,表明BoFLC3 基因可能参与了植物的抗寒反应。     

北京市农林科学院蔬菜研究中心科研进展

●在国际上首次从胡萝卜中分离克隆了ＬＹＣ ｂ、ＬＹＣ ｅ和ＣＣＳ三个控制α-和 β -胡萝卜素生物合成的相关基因和ｗｍｌｌｐ片段。进行了 β一环化酶基因启动子和西瓜果实特异性启动子的研究 ,瞬间表达实验证明了这两个基因具有启动子活性。转疟疾基因生菜Ｓ2 代植株的ＡＷＦＥ ＣＴＢ蛋白测定 ,呈阳性反应的植株达到 80 %以上 ,证明转基因生菜具有疟疾抗原特性。●大白菜的耐热性已成为重要的育种目标 ,以重组近交系 (ＲＩＬ)群体为材料 ,进行供试ＲＩＬ苗期耐热性鉴定 ,用多元线性回归方式计算并确定与大白菜耐热性状连锁的分子标记 ,…     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因，分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征，通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明，CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp，编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达，而在低感品种四季橘中上调表达；在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达，而晚锦橙中上调幅度较小；两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显；超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株；抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）；转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高；水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述，CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因，它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

RIP和TCS双价转基因草莓抗草莓镶脉病毒鉴定

用小叶嫁接法对农杆菌转化RIP和TCS双价抗病毒基因所获得的草莓品种森嘎拉和戈雷拉转基因植株接种草莓镶脉病毒,采用PCR方法检测嫁接成活后的转基因草莓苗草莓镶脉病毒。结果表明:这2个品种的转基因植株均有部分植株未扩增出草莓镶脉病毒特异条带,说明转入的外源基因具有一定的抗草莓镶脉病毒作用。     

分泌型Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平

 为了利用Cecropin B（CB）抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性,人工合成了两个含有信 号肽的Cecropin B 抗菌肽基因PR1aCB 和AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明,与非分泌型CB 抗菌肽 相比,PR1aCB 和AATCB 抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一步构建了CaMV 35S 调控 PR1aCB 和AATCB 基因的植物表达载体,转化塔罗科血橙（Citrus sinensis Osbeck）上胚轴,获得转基因植株。GUS 组织化 学染色、PCR 和Southern blot 分析表明外源基因已成功整合入柑橘基因组。Real-time PCR 定量分析表明, 抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。柑橘叶片离体抗性分析表明,转PR1aCB 和AATCB 基因植株的抗 性显著强于非转基因植株,其抗性水平与高抗品种‘南丰蜜橘’（C. succosa Hort. Ex Tan）和‘四季橘’ （C. madurensis）相当。     

番茄漆酶基因LeLACmiR397的克隆与表达分析

通过BLAST分析,获得了番茄漆酶（Laccase,LAC）基因相关的15个EST片段,并对这些EST进行了同源比较和序列拼接,得到1个含有小分子RNA miR397识别位点的LAC片段,命名为LeLACmiR397。根据蛋白质结构域推测,LeLACmiR397蛋白存在1个Cu–氧化酶结构域。LeLACmiR397时空表达分析表明,其在番茄根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达,而在叶中不表达。根据该片段的核苷酸序列信息进行5′-和3′-RACE扩增,得到了番茄LAC基因的全长cDNA（LeLACmiR397,登录号EU503151）,其在番茄基因组中对应的基因为Solyc07g049460.2.1。通过在番茄中过表达miR397a基因,发现转基因番茄中LeLACmiR397表达量降低,同时其PPO、POD、SOD含量也有所下降。用丁香酸和芥子酸处理转基因植株幼苗,其根系比非转基因植株更长,抗性增强,表明LeLACmiR397与番茄植株的抗性反应有关。     

异源表达拟南芥赤霉素2–氧化酶基因对矮牵牛形态发育的影响

拟南芥赤霉素2–氧化酶基因AtGA2ox1在矮牵牛（Petunia hybrida）中过量表达导致转基因植株开花延迟,株形明显矮化,花冠变小,花冠表皮细胞变小,但花色变化不明显。施用多效唑对矮牵牛花冠的影响与过量表达AtGA2ox1一致。用拟南芥茎特异性表达基因At3g56700的启动子驱动AtGA2ox1在矮牵牛中表达时,转基因植株的表型变化在株系间存在明显的差异,但外源基因在茎中的表达量都明显高于叶和花中的,果实和种子的发育未受影响,通过对转基因后代的筛选可以获得株形矮化,其它性状的发育受影响较小的转基因株系。