赤眼鳟Toll样受体9基因的cDNA全长克隆及表达特性分析

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Toll样受体9基因(toll–like receptor 9,ScTLR9)的结构特性及其参与免疫应答草鱼呼肠弧病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染时的表达特性,采用RACE技术克隆Sc TLR9基因c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术比较分析ScTLR9免疫应答GCRV的表达特性。结果显示:ScTLR9的cDNA全长为3 687 bp,编码1 059个氨基酸,有17个富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeats,LRRs)结构域。ScTLR9在被检测的9个组织中均有表达,在中肾和头肾中的表达量最高;感染GCRV后,基因TLR9在赤眼鳟和草鱼头肾中的表达量均上调,在赤眼鳟头肾中的表达量于感染后12 h达到峰值,推测TLR9参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答,且在抗GCRV入侵免疫反应中赤眼鳟较草鱼的免疫应答更为迅速。     

水稻冷诱导蛋白激酶基因CIPK07g 的克隆与表达分析

CIPK是一类Ca2+依赖的蛋白激酶超基因家族。对水稻中该基因家族成员之一CIPK07g进行克隆,并对其编码蛋白的信号肽、跨膜结构、结构功能域、时空表达特性和低温处理的表达特征进行分析。结果表明,CIPK07g基因c DNA全长1 891 bp,包含279 bp 5′UTR及259 bp 3′UTR,编码450个氨基酸组成的多肽链。该基因蛋白N端无信号肽,含跨膜结构域,为亲水蛋白,具有CIPK基因家族特有的保守结构域,在叶片中表达较高,低温刺激后24 h表达达到高峰。     

鳡胰岛素样生长因子1基因的克隆及其组织特异性表达分析

为克隆鳡(Elopichthys bambusa)的胰岛素样生长因子1(IGF1)全长cDNA和启动子序列及明确其组织表达特征,采用反转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)和染色体步移等技术,从鳡肌肉中获得了IGF1基因的全长cDNA(844bp)和上游启动子部分序列(627bp)。结果表明:IGF1基因包含218bp的5′端非翻译区、140bp的3′端非翻译区和486bp的开放性阅读框(ORF),编码161个氨基酸,包含前44个氨基酸残基为信号肽、70个氨基酸残基的4个功能结构域和C端47个氨基酸残基的延伸肽结构域。启动子无TATA框,但含有一成肌分化抗原(Myo D)结合位点。氨基酸同源性和系统发育分析发现,鳡IGF1与鲤形目其他鱼类的同源性较高(94.41%～99.38%),亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,IGF1在鳡的肝脏中表达最高,而心脏中未见其明显表达。该研究为明确IGF1参与鳡生长发育的机制研究及其在鳡的繁殖育种中的应用奠定了基础。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

虹鳟PDCD6基因cDNA全长的克隆与功能预测

程序性死亡因子6（PDCD6）基因编码1个含EF-hand结构域的钙离子结合蛋白。应用逆转录PCR及cDNA末端快速扩增（RACE）技术从虹鳟（Oncorhynchus mykiss）脑组织中克隆了PDCD6基因cDNA的全序列（GenBank No：FJ591154）。序列全长1 179bp,其中5’端非翻译区长48bp,3’端非翻译区长567bp,开放性阅读框长564bp,编码187个氨基酸。电子表达谱分析结果表明该基因在4种脊椎动物的多个部位或组织中均有表达。同源模建蛋白三级结构显示该蛋白具有8个主要的α螺旋结构。虹鳟PDCD6蛋白序列与斑马鱼、非洲爪蟾、人、小鼠和鸡的同源性均高于85%,表明PDCD6基因在进化过程中是高度保守的,在细胞程序性死亡过程中发挥重要作用。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

合浦珠母贝C型凝集素2的序列特征和表达分析

构建了合浦珠母贝(Pinctada fucata)的cDNA文库,并通过EST序列筛选和重新测序获得了一个新的C型凝集素基因的cDNA序列,命名为PoLEC2,其长度为1 659 bp,5’端非编码区为39 bp,3’端非编码区为45 bp,开放阅读框为1 575 bp,可编码524个氨基酸;PoLEC2蛋白的分子量约58.0 kD,等电点为5.2;PoLEC2蛋白包含一个信号肽序列(M1-A16)、一个MAM-2结构域和一个C型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明,PoLEC2与其他物种C型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26.5%～33.6%,相似性在45.1%～55.6%。组织表达分析表明,PoLEC2基因在肝胰脏、鳃、外套膜、性腺及肠组织中均有表达,经溶藻弧菌刺激后8h在肠组织中的表达量显著上调。     

母源因子boule在光棘球海胆性腺中的表达与定位

为鉴定光棘球海胆Mesocentrotus nudus生殖细胞标记基因,通过基因克隆、荧光定量PCR及切片原位杂交等技术分析了光棘球海胆(湿体质量为76.8 g±10.0 g)母源因子(boule)基因的分子特征及动态表达模式。结果表明:光棘球海胆boule cDNA序列全长为1788 bp,其中,3′非编码区为601 bp,5′非编码区为146 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1041 bp,共编码346个氨基酸,包含一个保守的RRM结构域;荧光定量PCR结果显示,boule为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达;boule基因在处于生长期(stageⅡ)光棘球海胆的肠、管足、体腔液和性腺中均有表达,其中,boule基因在精巢表达量最高(P<0.05);在卵巢中表达量随卵母细胞的成熟而逐渐升高,在成熟期(stageⅣ)卵巢中达到最高,精巢中表达量仅在生长期(stageⅡ)及成熟前期(stageⅢ)有较高表达;切片原位杂交显示,boule基因在光棘球海胆精巢的生殖细胞中特异表达,卵巢中未检测到阳性细胞信号。研究表明,光棘球海胆boule基因是雄性生殖细胞标记基因,本研究结果可为海胆雄性生殖细胞发育相关研究提供数据资料。     

牛 TRAF6基因编码区的克隆及序列分析

为了探讨牛 TRAF6基因的结构与功能、采用基因克隆技术分离了牛 TRAF6基因的编码区序列、并采用 生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的序列特征、结构和功能。结果表明院分离了 TRAF6 基因 1 803 bp 的 cDNA 序列（GenBank 登录号为 DQ471669）、编码区长度为 1 629 bp、编码 542 个氨基酸（GenBank 登录号 为 ABF06558）、位于细胞核、细胞质、线粒体、内质网等多种细胞器上、分子量为 61. 57176 ku、等电点为 6. 09、含有 RI NG-f i nger 、zf -TRAF 和 M ATH_TRAF6结构域。 该蛋白与人、小鼠和大鼠 TRAF6蛋白的同源性分别为 89% 、84% 和 82% 、 其结构域的同源性均达到 95% 以上。 根据各物种间 TRAF6 蛋白的高同源性、 结合人和小鼠 TRAF6 蛋白在 TNF/ TLRs/ TI R 超家族介导的信号转导途径中的重要作用、推测牛 TRAF6 蛋白也可能参与调节多种信号通路、在免 疫反应、炎症反应、细胞分化和凋亡等生物学过程中发挥重要功能。     

口虾蛄卵黄蛋白原(Vg)基因的初步研究

为研究口虾蛄Oratosquilla oratoria卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)基因,利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆口虾蛄Vg基因c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR422400),并应用相对实时荧光定量PCR技术检测雌雄口虾蛄不同组织、不同发育时期卵巢Vg mRNA的表达量。结果表明:口虾蛄Vg基因全长7727 bp,其中5'端非编码区为36 bp,开放阅读框(ORF)为7521 bp,3'端非编码区为170 bp,共编码2506个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为20个氨基酸的信号肽,1个类似于枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点(RSKR),3个潜在的N-连接糖基化位点,1个在无脊椎和脊椎动物卵黄蛋白原中都比较保守的KALGNVG基序;对其结构域分析表明,口虾蛄Vg蛋白含有4种保守结构域,分别为卵黄蛋白原N端结构域(Vitellogenin_N)、血管性血友病因子(v WFD)和两种未知功能结构域(domain of unknown function)DUF1943与DUF1081;经NCBI BLASTP同源性比较,口虾蛄Vg氨基酸序列与其他甲壳类的相似性为46%~52%;系统发育分析结果显示,口虾蛄Vg单独聚为一支;实时定量PCR结果显示,口虾蛄Vg基因在性腺和肝胰腺中均有表达,在肌肉中均不表达,卵巢中Vg mRNA的表达量显著高于其他组织(P0.05),且口虾蛄Vg mRNA的相对表达量随着卵巢的发育不断增加(P0.05),在成熟期时达到最高值,随后显著下降,Vg mRNA表达量在卵巢中的变化规律可以作为了解口虾蛄性腺发育的有效指标。本研究结果为口虾蛄Vg蛋白的功能研究奠定了基础。     

西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因的克隆与表达模式分析

摘要[目的]克隆西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum La3xm．）乙二醛酶Ⅱ基因并了解该基因表达模式。[方法]应用RACE技术和实时荧光定量PCR技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的乙二醛酶Ⅱ基因的cDNA序列,并对该基因在不同胁迫时间、不同组织的表达差异进行了比较。[结果]克隆的乙二醛酶Ⅱ基因cDNA为890bp,其中开放读码框为765bp,编码254个氨基酸,5’非翻译区为49bp,3’非翻译区为72bp,GenBank中登录号为HM241910。序列比对分析结果表明,该基因编码的乙二醛酶Ⅱ与乙二醛酶Ⅱ三型匹配最佳,并具备乙二醛酶Ⅱ的GloB、ComEC和Lactamase,B等结构域。实时荧光定量PCR分析显示,乙二醛酶II基因在正常生长的西伯利亚蓼地下茎、茎与叶中都有表达,其中茎的表达量最高。同时,乙二醛酶Ⅱ基因受3％NaHCO,胁迫诱导,其在不同部位的表达模式有差异。[结论]克隆了西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因并初步阐明了其表达模式。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

元江普通野生稻金属硫蛋白(YJMT-2)的获得及序列分析

对SMARTTM技术构建的元江普通野生稻叶片cDNA文库克隆进行随机测序,获得了元江普通野生稻金属硫蛋白(YJMT-2)的cDNA序列。该序列全长为558 bp,5′-端非翻译区为84 bp,3′-端非翻译区为247 bp,开放阅读框长度为225 bp(包括一个终止密码子),可编码74个氨基酸,蛋白分子量为7.51 kD,理论等电点(PI)为6.51,其中含12个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的16.22%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC排列方式,具有植物MT-2的典型特征;经Pfam15.0分析证明,其属于金属硫蛋白家族的成员。BlastP同源性分析,该基因与日本粳稻、大麦的同源性较高,分别为98%和65%。首次得到元江普通野生稻金属硫蛋白基因,为其功能研究提供了基础。     

大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

[目的]探讨重金属对大珠母贝苗种存活的影响。[方法]对大珠母贝金属硫蛋白基因进行克隆和序列分析。[结果]结果表明,通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599 bp,5′UTR（Un-translated region）为75 bp,3′UTR为296 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）为228 bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。[结论]该研究为海洋贝类金属硫蛋白的进化及功能研究提供基础资料。     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶（ Cu/Zn-SOD）基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明：双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5′端非编码区,261 bp 3′端非翻译区和453 bp 开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2＋和Zn2＋结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD 蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15249900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析

[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2 947 bp,开放阅读框(ORF)2 418 bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1 receptor)。该蛋白的分子量为91.15 kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%～35%,TIR序列的同源性达到84%～62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).