红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2基因的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。     

黄鳝性逆转相关基因的克隆和表达

运用cDNA末端快速扩增(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE)技术和半定量RT-PCR技术,克隆了黄鳝(Monopterus albus)性腺差异表达基因(F64)的cDNA全长序列,分析了该基因于各期性腺组织的表达情况。结果表明,F64基因cDNA全长1 721 bp,含有142 bp的5’-UTR、268 bp的3’-UTR、1 311 bp的开放阅读框(ORF),共编码436个氨基酸;在线SignalP分析表明,F64亚基肽链不存在信号肽,为非经典分泌蛋白;同源性分析结果显示该基因无同源性序列,视为新报道的基因;F64在卵巢发育早期不表达,从排卵的Ⅴ期卵巢开始表达,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。     

小体鲟卵透明带家族ZP3亚型和ZPAX基因cDNAs克隆及其组织表达分析

为研究透明带ZP家族在小体鲟Acipenser ruthenus性腺发育、卵子发生等过程中所发挥的作用,采用PCR技术克隆获得小体鲟卵透明带家族ZP3 3种亚型(ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5)及ZPAX基因(ArZPAX)cDNA部分序列。结果表明:ArZP3-1部分cDNA序列长度为1029 bp,对应编码342个氨基酸;ArZP3-4部分cDNA序列长度为1191 bp,对应编码397个氨基酸;ArZP3-5部分cDNA序列长度为717 bp,对应编码238个氨基酸;ArZPAX部分cDNA序列长度为733 bp,对应编码243个氨基酸;ArZP3蛋白3种亚型及ArZPAX蛋白氨基酸序列中均含有一个保守的ZP结构域;基于ZP氨基酸序列的系统发育树显示,小体鲟ArZP3蛋白3种亚型与高等鱼类ZP3亲缘关系较近,而ArZPAX蛋白则与哺乳类、鸟类、高等鱼类和爬行类ZPAX亲缘关系均较远;通过半定量RT-PCR进行组织表达特异性分析表明,ArZP3-1基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、脑、肾、心、肌肉、鳃中表达,ArZP3-4基因仅在小体鲟卵巢和精巢中表达,而ArZPAX基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、肠、肾、脾、心、鳃、脑中均有表达,3个基因在性腺中的表达量均最高,且均具有雌、雄差异性表达特点。     

斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

中华绒螯蟹卵黄蛋白原基因cDNA序列的克隆与结构分析

通过RT-PCR,RACE等技术克隆得到中华绒螯蟹卵黄蛋白原的cDNA序列全长,其长度为7 921 bp,软件分析后知其含有一个7 689 bp的开放阅读框,其5′和3′的非翻译区分别为28 bp和204 bp; 预测该序列编码一个含2 562个氨基酸残基的蛋白质,和其它已知卵黄蛋白原序列的蟹类相比,理化性质、空间构型相似,且含有2个结构域：参与脂质转运的卵黄蛋白原N端结构域（Vitellogenin_N）,以及血管性血友病因子（von Willebrand factor）D型结构域（VWD）。将其开放阅读框翻译为氨基酸序列后进行数据库对比（BLASTP）,与其他已知的甲壳类卵黄蛋白原序列间存在33%～77％的相似性。     

大刺鳅促黄体生成素基因克隆及其组织表达分析

[目的]克隆大刺鳅(Mastacembelus armatus)促黄体生成素(LH)基因及明确其表达规律,为进一步阐明LH基因在大刺鳅性腺发育过程中的生理功能及揭示大刺鳅的生殖调控机理提供参考依据.[方法]采用RACE克隆大刺鳅LH基因cDNA全长序列,从GenBank中选择硬骨鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物等物种的LH氨基酸序列,通过ClustalX 2.1进行氨基酸序列比对,以MEGA 6.0中的邻接法(NJ)构建系统发育进化树,并应用实时荧光定量PCR检测分析大刺鳅LH基因在不同组织及不同性腺发育期的表达情况.[结果]大刺鳅LH基因cDNA序列全长799 bp,包括224 bp的5'非编码区(5'-UTR)、131 bp的3'非编码区(3'-UTR)和444 bp的开放阅读框(ORF),共编码147个氨基酸残基,第1~22位氨基酸残基组成其信号肽区域.大刺鳅LH氨基酸序列C-末端区域高度保守,但N-末端区域与其他硬骨鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物存在明显差异.大刺鳅LH氨基酸序列与其他鱼类的LH氨基酸序列同源性较高,其中与黄鳝(Monopterus albus)的亲缘关系最近.大刺鳅LH基因在其脑组织中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05);在卵巢、心脏、肝脏和精巢中的相对表达量次之;大刺鳅LH基因在不同发育期卵巢和精巢中的表达变化趋势一致,从II期开始其相对表达量随之增加,至V期时达峰值.[结论]大刺鳅LH氨基酸序列具有高度保守区域,其基因在各组织中广泛表达,尤其在脑组织和性腺中具有较高表达量,提示LH的靶基因可能在脑—垂体—性腺轴上,参与大刺鳅的性腺发育调控,主要促进卵母细胞和精子成熟并刺激排卵或排精.     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

斑节对虾腺苷酸转移酶(PmANT)基因的cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2r基因的克隆及表达分析

为了解泛素结合酶E2r基因在克氏原螯虾性腺发育中的作用,利用RACE技术得到了c DNA全序列,命名为Pc-UBE2r。该基因序列全长为3 671 bp,包含泛素结合酶的特有结构域,以及半胱氨酸残基活化位点。开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸,预测蛋白分子量约为27.6 ku。BLAST比对发现,克氏原螯虾UBE2r基因与节肢动物UBE2r基因具有较高的同源性。系统进化分析表明,Pc-UBE2r基因与日本囊对虾聚为一枝。qRT-PCR研究表明,Pc-UBE2r基因在性腺中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。在卵巢中,PcUBE2r基因的表达量在未发育期最低,在卵黄发生前期表达量快速增长,随后表达量逐渐降低。在精巢中,Pc-UBE2r基因的表达量在精母细胞发生期达到最高水平。组织原位杂交结果显示,Pc-UBE2r基因在卵巢中均匀分布在未发育期的卵母细胞细胞质中,随后逐渐迁移到卵母细胞细胞核以及滤泡细胞周围。在精巢中,Pc-UBE2r基因主要分布在精母细胞的周围。组织总蛋白Western blot检测发现,UBE2r蛋白在精巢和卵巢中的表达量也显著高于其他组织(P0.05)。综上所述,我们推测Pc-UBE2r基因在克氏原螯虾配子发生和性腺发育方面发挥了重要作用,本研究将为虾蟹类性腺发育调控的分子机制奠定基础和提供依据。     

SD-大白鼠催乳素受体基因的克隆与表达

应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。     

香猪ATGL基因的克隆、验证及其在不同猪品种的编码区序列比较

ATGL基因是近年来发现的一个新基因,其表达产物脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)被证明是催化三酰基甘油水解第一步反应的限速酶.本研究采用电子克隆和RT-PCR的方法克隆并验证了贵州小香猪ATGL基因的cDNA序列.克隆的香猪ATGL基因其cDNA序列全长2 102 bp,其中编码区1 461 bp,编码486个氨基酸.通...     

花鲈瘦素基因的克隆及低盐度条件下调控表达分析

瘦素(Leptin,Lep)在动物摄食、生长、生殖、免疫、能量平衡等方面具有重要作用,为研究花鲈Lateolabrax maculatus Lep功能,采用c DNA末端快速扩增法(RACE)克隆花鲈Lep A c DNA全长序列。急性低盐度调控试验设置海水组(盐度32)、半海水组(盐度16)和淡水组(盐度0),盐度调控24、48、96、144、192 h后测定花鲈肝脏中Lep A mRNA的表达情况。结果表明:Lep A c DNA全长序列为643 bp,其中开放阅读框483 bp,编码161个氨基酸,其氨基酸序列由信号肽和A、B、C、D 4个α螺旋区域组成;花鲈Lep A氨基酸序列与其他物种同源性较低,但三级结构较为保守;花鲈Lep A主要在肝脏中表达,其次为脑;低盐调控48 h时,半海水组与淡水组Lep A表达无显著性差异(P0.05),但均显著低于海水组(P0.05),分别为海水组的33.38%和26.86%。研究表明,急性低盐度调控可降低花鲈Lep A表达水平。     

肉鸡MTHFR基因的克隆和表达水平研究

采用RT-PCR方法克隆了鸡MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用定量PCR(qPCR)技术检测组织表达特性。结果表明,鸡MTHFR基因的cDNA序列长度为2 342 bp(GenBank登录号: KU351685),开放阅读框长1 956 bp,编码651个氨基酸;进化树分析表明,鸡MTHFR氨基酸序列与绿头鸭和鸿雁的关系较近。MTHFR氨基酸序列包含保守的MTHFR superfamily结构域,为亲水蛋白;二级结构主要是α-螺旋(38.71%)和无规则卷曲(36.41%);亚细胞定位显示,该蛋白存在于细胞质和细胞核的概率分别为60.9%和30.4%。qPCR分析表明,MTHFR基因在所检测鸡的8种组织中均有表达,其中在心脏中表达水平最高,在腿肌中的表达水平最低;叶酸缺乏试验表明,母鸡叶酸缺乏能极显著增加子代肉鸡MTHFR基因在肝脏中的表达水平(P<0.01)。研究结果可为进一步研究MTHFR基因的结构和功能以及叶酸在家禽生产中的应用提供资料。     

花生长链酰基辅酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鉴定与组织表达

长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase:LACS)是油脂代谢的重要催化酶。为揭示花生脂肪酸代谢机理,采用RT-PCR技术,首次从花生Arachis hypogaea L.克隆到LACS6(GenBank登录号:KU301860),分析该基因的结构组成,预测编码氨基酸与其他植物的同源性,采用Real-Time PCR技术对LACS6的组织表达进行研究。结果显示,花生LACS6基因全长2 116bp,包含2 088bp的ORF,编码695个氨基酸,有23个外显子和22个内含子。氨基酸序列比对显示花生LACS6有真核生物酰基辅酶A合成酶保守结构域,并含有保守的激活位点和绑定位点。同源性分析发现花生LACS6与鹰嘴豆、绿豆、大豆、梅等13种物种的氨基酸一致性在79%~87%,进化树分析显示,花生LACS6与鹰嘴豆等豆科植物亲缘较近。实时荧光PCR分析表明,花生LACS6在花生根、茎、叶、子房柄、仁和花等组织均有表达,且差异明显。子房柄和花的表达量极高,与根、茎、叶和仁等组织有极显著差异,花生LACS6组织的表达量大小排序为花子房柄叶仁茎根。本研究结果为揭示花生脂肪酸代谢和品质改良提供理论依据。     

凡纳滨对虾内质网膜转运通道蛋白基因Sec61γ的克隆及表达分析

以生长性状为指标分离凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei家系的肌肉组织,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,进行斑点杂交筛选获得内质网膜转运通道蛋白基因Sec61γ基因,克隆获得cDNA全长编码序列及部分非编码序列。序列包含270 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为89个氨基酸,预测的相对分子质量为10 300,理论等电点为10.58。通过荧光定量PCR的方法研究了Sec61γ基因在对虾不同组织和不同生长期肌肉组织中的表达情况,结果表明：Sec61γ基因在对虾的血液以及心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄等器官或组织中都有表达,其中在肌肉组织中表达量最高,在肠中表达量最低;在对虾不同生长期肌肉中的表达量各不相同,在10日龄的对虾肌肉组织中表达量最高,为45日龄的对虾肌肉组织中表达量的27.6倍。     

白菜雄性不育相关新基因BcMF1的分离及特征分析

【目的】筛选与白菜雄性不育性状相关的新基因,为研究植物雄性不育的分子机制提供依据。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析白菜核雄性不育两用系‘ZUBajh97-01AB ’的表达差异,在可育株群中扩增出1条特异条带BcMF-A15T17,通过RACE和PCR技术扩增得到该基因的cDNA和DNA全长序列,并用Northern杂交验证了该基因的表达特征。【结果】该基因被命名为BcMF1,它的cDNA全长为1 684 bp,基因全长为1 985 bp,BcMF1基因仅在两用系可育株群的中、大花蕾中特异表达。推测的BcMF1蛋白含有471个氨基酸,与拟南芥未知功能蛋白家族DUF1216成员的相似性较高,预测该蛋白是一个定位在胞外的分泌蛋白。【结论】BcMF1基因是一个与白菜细胞核雄性不育相关的新基因。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

Cloning and Characterization of a PGIP-Encoding Gene from Solanum torvum

Verticillium wilt is a severe disease in eggplant caused by Verticillium dahliae.Polygalacturonase-inhibiting proteins （PGIPs） have been shown to be involved in preventing the invasion of fungus including V.dahliae.Cloning genes encoding PGIPs is quite valuable for plant resistance breeding to Verticillium wilt.In this study,a cDNA encoding the polygalacturonase-inhibiting protein was isolated from Solanum torvum by RT-PCR and RACE,designated StPGIP （accession no.FJ943498）.The cDNA sequence of StPGIP was 1 097 bp long and contained an open reading frame of 990 bp.The predicted amino acid sequence of the gene consisted of 329 amino acids and had conserved LRRs.The StPGIP protein had a high identity with PGIPs from other species.Analysis of StPGIP expression at the mRNA level by RT-PCR showed that the gene was expressed in all organs and could be induced to increase expression by V.erticillium dahliae infection.