大白菜果胶甲酯酶基因BrPME1的克隆及特征分析

 【目的】克隆大白菜果胶甲酯酶基因,为进一步探讨果胶代谢在大白菜育性调控中的分子机制提供帮助。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-24,通过RACE技术扩增该基因的cDNA全长序列,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,利用荧光定量PCR技术分析基因时空表达模式。【结果】该基因编码大白菜果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11),被命名为BrPME1(GenBank登录号：HM185497)。BrPME1全长cDNA序列为1 290 bp,编码1个包含363个氨基酸的前体蛋白。BrPME1蛋白N末端1—23位为信号肽,成熟蛋白含有保守的果胶甲酯酶酶活结构域,而不含酶活抑制位点。预测BrPME1蛋白含有10个磷酸化位点、1个酰胺化位点和6个N端豆蔻酰基化位点。BrPME1在两用系不育株花蕾中表达量很低,在可育株的大花蕾以及成熟花药中高水平表达。【结论】BrPME1是一个受大白菜细胞核雄性不育基因抑制的果胶甲酯酶基因家族成员。     

白菜核雄性不育两用系花蕾的mRNA差别显示及其cDNA差异片段分析

用mRNA差别显示技术对白菜核雄性不育两用系中不育株群与可育株群花蕾总RNA进行了比较分析.在6种反转录模板和20种差异随机引物共120种组合的选择扩增中共回收了18个cDNA差异片段,对其中6个cDNA差异片段进行Northern验证,获得了一个白菜核雄性不育两用系可育株群并在花蕾中特异表达的阳性差异片段,简称为B0302-4.Northern验证结果表明它在不育株中的表达受到了明显的抑制,其长度为463 bp.经GenBank BLAST查询,它与拟南芥第一条染色体上编码细胞色素P450的基因CYP86C4核苷酸序列有84.3%的同源性.     

白菜核雄性不育两用系AFLP扩增特异片段的克隆及序列分析

利用AFLP技术从白菜核不育两用系"矮脚黄"可育系DNA中得到一个特异扩增片段MF-14.Southern杂交结果证实不育系也存在该片段的同源序列;回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-T Easy载体进行序列测定.测序结果表明,该片段全长289 bp,其碱基组成为A+T=46.02% .与白菜RAPD特异片段S107及其他育性相关基因核苷酸序列比较,同源性均低于50% .表明该片段为一新的序列.     

利用cDNA-AFLP技术分析白菜核雄性不育两用系的表达差异

 利用cDNA AFLP技术 ,对白菜核雄性不育两用系可育株群和不育株群分析显示 :花蕾之间基因表达存在差异 ;莲座期叶片之间、开花期叶片之间和花茎之间基因表达无差异 ;叶片、花茎和花蕾之间基因表达存在差异。对开花期的小蕾、中蕾和大蕾分析显示 :10对引物中 ,1对在可育株中蕾和大蕾中扩增出 1条特异带 ,另 1对扩增出 1条在可育株中蕾中表达丰度高于不育株中蕾的条带 ,其余 8对未发现差异条带。对上述表达丰度有差异的基因进行Northern验证 ,结果与之一致 ,表明cDNA AFLP技术可以用于植物雄性不育基因表达差异的研究。     

大白菜CMS雄性不育发生相关基因的克隆与分析

【目的】筛选和克隆与大白菜CMS雄性不育相关的应答基因。【方法】以大白菜不育系06J45和恢复系01S325-1为材料,利用cDNA-AFLP方法从F2S5群体不育株和可育株花蕾中筛选分离差异表达基因,通过RACE技术对该差异表达基因进行克隆,对基因序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR定量分析不育株和可育株花蕾发育过程中基因表达的变化。【结果】在F2S5可育株花蕾cDNA混合池中扩增出1条特异表达条带,通过3′RACE和5′RACE克隆得到相应的BrUP基因,全长1 407bp,编码403个氨基酸残基。生物信息学分析表明,BrUP基因与大白菜Bra007268基因序列相近,由6个外显子和5个内含子组成,与拟南芥未知功能基因AT3G56750同源,一致性达90%。保守结构域分析表明,BrUP基因可能是1个具有跨膜结构的O-型岩澡糖基转移酶基因,主要功能是进行糖基化修饰。qRT-PCR定量发现,BrUP只在花蕾发育早中期表达,且在大白菜不育株花蕾发育早期其表达量显著性下调。【结论】成功筛选克隆获得1个与大白菜雄性不育发生相关的功能未知基因BrUP。     

白菜雄性不育相关基因BcMF4的反义RNA验证

根据普通白菜(Brassica campestris ssp.chinensis var.communis)雄性不育相关基因BcMF4的cDNA序列设计特异引物,从普通白菜花蕾cDNA中扩增出607 bp的片断,然后将该片段连接至双元载体pBI12l中,得到反义RNA植物表达载体并导入农杆菌LBA4404菌株中;通过组织培养途径转化菜心(B.campestris ssp.chinensis var.parachinensis),得到了12株转基因植株,其中5株的43.7%的花粉为缩小空瘪畸形,29.6%的花粉缺乏生活力,而且其花粉离体萌发率降低至24.7%.结果表明,反义RNA技术沉默BcMF4基因导致了菜心转基因植株的部分花粉发育不良,BcMF4基因在普通白菜和菜心等花粉发育中起着重要作用.     

白菜细胞核雄性不育两用系的性状比较分析

用比较分析的方法，对白菜核雄性不育两用系中不育株与可育株的植株性状、育性、花器结构和花粉扫描电镜形态等进行观察研究，结果表明：白菜核雄性不育两用系中不育株花粉败育彻底，不育株与可育株呈1：1分离，是一种稳定可靠的核雄性不育两用系；对不育株与可育株花蕾总蛋白进行了SDS-PAGE凝胶电泳，发现不育株与可育株都有各自的一条特异蛋白条带，分别命名为A-1和B-1，两者的表达量都比较高。     

白菜雄性不育相关基因BcMF3功能的反义RNA验证

为了研究白菜等十字花科植物花粉发育及雄性不育发生的机理,根据编码果胶甲酯酶的白菜雄性不育相关基因BcMF3的cDNA序列设计特异引物,从普通白菜(Brassica campestris ssp.chinensis var.communis,syn.B.rapa ssp.chinensis var.communis)花蕾cDNA中扩增出458 bp的片断,构建BcMF3的反义RNA植物表达栽体,然后转化菜心(B. campestris ssp.chinensis var.parachinensis).研究发现,31.3%菜心转基因植株花粉表现出畸形,而且只有部分花粉具有活力,花粉离体萌发率降低为31.6%,其花药果胶甲酯酶活性降低了12.8%.上述结果表明BcMF3基因与普通白菜和菜心等白菜植物的花粉发育密切相关.     

mRNA差异显示分离西瓜核雄性不育基因的相关cDNA片段

【目的】揭示西瓜核雄性不育发生的分子机理。【方法】应用mRNA差异显示技术,研究西瓜核雄性不育材料Se18不育株和可育株雄花花蕾中基因表达的差异。【结果】获得了西瓜细胞核雄性不育两用系不育相关特异cDNA片段T12C/B0315S-359和育性相关特异cDNA片段T12C/B0315F-175、T12G/B0318F-260。经过序列比较,T12C/B0315S-359与美洲杨树一段未知的cDNA序列同源性较高(82%);T12C/B0315F-175与葫芦科植物中编码细胞色素C装配蛋白的ycf5基因高度同源(98%);T12G/B0318F-260与植物中硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxinperoxidase,TPx)基因高度同源(84%)。【结论】经序列分析初步认为,这3个片段与西瓜细胞核雄性不育的发生有重要相关性。     

大白菜快速碱化因子BrRALF1的克隆与特征分析

利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育"两用系"AB02可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异表达条带TDF-3,通过RACE和RT-PCR技术克隆了该基因的cDNA全长序列.序列分析表明,该基因编码大白菜快速碱化因子,被命名为BrRALF1;BrRALF1全长cDNA序列为551bp,编码1个包含79个氨基酸残基的前体蛋白;前体蛋白N末端1～28位为信号肽,成熟蛋白含有保守的YIXY结构域、YXRGC结构域和4个半胱氨酸残基;预测BrRALF1蛋白含有5个翻译后修饰性位点.表达模式分析表明.BrRALF1在可育花的花丝、花药、雌蕊、萼片、花瓣中均表达,其中在花药中表达量最高;BrRALF1表达在不育株上受到强烈抑制.     

辣椒GMS育性相关候选基因的克隆及表达分析

【目的】对辣椒差减文库中挑选出的4个育性相关候选基因进行克隆与表达分析,探讨其与辣椒细胞核雄性不育的关系。【方法】通过半定量RT-PCR技术分析候选EST在辣椒可育株和不育株中的表达情况。利用RACE技术获得4个育性相关基因的cDNA 全长,结合生物信息学方法进行序列比对和蛋白理化性质分析。采用半定量RT-PCR检测基因在不同器官（花药、子房、花瓣、萼片和叶片）和花药小孢子不同发育时期（四分体时期、单核早中期、单核靠边期和双核期）的表达量。【结果】根据比对注释结果,将4个基因分别命名为CaSEP1、CaPROF、CaOle e 6和CaPCP。CaSEP1全长1 108 bp,编码221个氨基酸,含有一个MADS结构域和一个K结构域;CaPROF全长767 bp,编码131个氨基酸,含有一个PROF结构域;CaOle e 6全长523 bp,编码85个氨基酸,含有一个Ole e 6结构域;CaPCP全长563 bp,编码66个氨基酸。氨基酸序列比对及系统发育树分析表明,CaSEP1与番茄SEP1的氨基酸序列相似性最高,并且亲缘关系最近;CaPROF与茄科作物烟草和番茄的前纤维蛋白相似性较高,且与番茄的前纤维蛋白亲缘关系最近;CaOle e 6与番茄中的对应蛋白存在一定的相似性,亲缘关系也最近;CaPCP则与茶树中的对应蛋白相似性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,CaSEP1在可育株花药、子房、花瓣等花器官中表达量一致,且高于萼片和叶片;CaPROF在可育株花药中的表达明显高于叶片,在其他器官中不表达;CaOle e 6在可育株花药中的表达明显高于其他器官;CaPCP只在可育株的花药中表达。CaSEP1在可育株小孢子不同发育时期表现为先逐渐升高,至单核靠边期达到最高,而后在双核期表达量明显下降,在不育株中则表现为伴随着小孢子发育表达量逐渐升高;该基因在四分体时期两材料的表达量相当,在单核早中期和单核靠边期可育株中的表达量明显高于不育株,而双核期可育株中的表达量比不育株低;CaPROF、CaOle e 6和CaPCP均在可育株小孢子发育后期（主要为单核靠边期和双核期）表达,在不育株花药发育的各个时期均不表达。【结论】4个候选基因的序列比对和表达分析结果表明它们与辣椒雄蕊育性关系密切,为揭示雄性不育机理和调控辣椒育性提供了重要信息。     

BcA9启动子调控的反义BcMF12对白菜基因沉默的效果

 【目的】探讨花药绒毡层特异启动子BcA9调控的反义BcMF12基因对白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis）基因沉默的效果,明确其对花粉发育的影响。【方法】在从白菜花蕾cDNA中克隆BcMF12基因的保守区段的基础上,将白菜花药特异表达启动子BcA9与反义BcMF12基因融合,构建反义表达载体,并经农杆菌介导导入到白菜基因组中,利用抗生素筛选和分子检测筛选出转基因植株。【结果】PCR和Southern检测结果表明,BcA9启动子驱动的反义BcMF12-GUS报告基因已整合到白菜基因组中;Northern杂交显示转基因植株花蕾和花中的BcMF12在mRNA水平的表达明显受到抑制,而且花粉萌发率显著下降。【结论】BcA9调控的反义BcMF12基因明显抑制了BcMF12的表达,从而影响白菜花粉的发育。     

大白菜雄性核不育基因的染色体定位及AFLP分子标记筛选

 【目的】基因定位是遗传研究的重点内容,也是育种工作的重要基础。本研究以大白菜雄性不育两用系‘大阳AB系’和大白菜系列初级三体为材料,对决定大白菜雄性不育性的核基因（ms）进行染色体定位和分子标记筛选,旨在为其分子克隆和遗传利用奠定基础。【方法】基因的染色体定位采用初级三体遗传分析和χ2测验法,分子标记采用AFLP分析方法。【结果】大白菜‘大阳AB系’的雄性不育系（msms）×大白菜系列初级三体（Tri-1、Tri-2、Tri-3、Tri-4、Tri-5、Tri-6、Tri-7、Tri-8、Tri-9）的9个杂交组合中,F1均为可育株;从F1选出三体植株进行自交和测交,其自交子代（F2）和测交子代（Tc）中可育株与不育株的分离比例,只有Tri-4表现为15.5﹕1（F2）和3.24﹕1（Tc）、不符合孟德尔的单基因遗传分离比例（3﹕1和1﹕1）,其它三体在2.60﹕1～3.76﹕1（F2）和0.81﹕1～1.48﹕1（Tc）、均符合孟德尔的单基因遗传分离比例（3﹕1和1﹕1）,这表明该雄性不育性的遗传与Tri-4的遗传表现一致,即确定该雄性不育性的基因位于大白菜4号染色体上。基于染色体和染色单体分离的三体遗传分析表明,该雄性不育基因位于4号染色体的近着丝点区域,通过对124个AFLP引物组合的筛选,初步获得了一个与雄性核不育基因位点连锁的AFLP标记E34M49(398 bp),遗传距离约为1.2 cM。【结论】利用初级三体遗传分析首次将大白菜雄性核不育基因定位在第4号染色体上。     

甘蓝型油菜双低显性细胞核+细胞质雄性不育系DGCMS-3A的构建及遗传模式研究

 【目的】验证显性核不育两用系与波里马三系的基因型,明确Gd1AB和D3AB显性核不育的遗传模式,并构建显性细胞核+细胞质不育系统。【方法】通过显性核三系与波里马三系相互杂交验证其基因型,分析Mf和Rfc基因的等位性,采用临保系与显性纯合两用系×显性核不育恢复系F2代核不育株测交的方法,推论显性纯合两用系Gd1AB和D3AB的遗传控制模式。C3B为轮回父本与不育胞质的显性核不育株定向回交,以创建显性核不育+细胞质不育。【结果】鉴别了Gd1AB和D3AB的遗传控制模式,确定甘蓝型油菜显性纯合两用系Gd1AB由一对复等位遗传模式控制,而显性纯合两用系D3AB由两对基因互作控制。初步构建出双低显性杂合核不育+细胞质不育系统DGCMS-3A,并证实了选育显性纯合核不育+细胞质不育系的可行性。【结论】显性抑制基因Mf与波里马恢复基因Rfc不等位,Gd1AB的基因型为N（MsMsrfcrfc）×N（MsMfrfcrfc）),D3AB的基因型为N（MsMsmfmfrfcrfc）×N（MsMsMfmfrfcrfc）。显性核不育+细胞质不育可细分为四种遗传模式：双位点互作显性杂合核不育+细胞质不育[S（Msmsmfmfrfcrfc）+S（msmsmfmfrfcrfc）]、单位点复等位显性杂合核不育+细胞质不育[S（Msmfrfcrfc）+S（mfmfrfcrfc）]、双位点互作显性纯合核不育+细胞质不育[S（MsMsmfmfrfcrfc）+S（MsMsMfmfrfcrfc）]、单位点复等位显性纯合核不育+细胞质不育[S（MsMsrfcrfc）+S（MsMfrfcrfc）]。     

葡萄雌能花相关基因VvMS2的克隆及表达分析

【目的】从欧亚种葡萄‘魏可’和‘钟山红’的花中分离出VvMS2基因,为研究葡萄雌能花形成的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中寻找与拟南芥雄性不育基因MS2同源性最高的葡萄序列（CBI29968）,设计特异引物进行克隆测序,通过生物信息学方法分析结构特征,利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在‘魏可’各组织中及‘魏可’和‘钟山红’雄蕊发育不同时期中的表达特性。【结果】VvMS2基因cDNA编码区全长为1 755 bp,编码584个氨基酸,含有NAD结合域和雄性不育C-末端区域。VvMS2对应基因组DNA全长2 776 bp,含有9个外显子和8个内含子。基因编码蛋白质分子量为64.74 kD,等电点为8.84。该基因与GenBank中其它来源的MS2蛋白序列的相似性为40%—71%。VvMS2为花蕾特异表达基因,且仅在花粉发育四分体期到二核期有表达,单核期‘魏可’的表达量显著高于同时期‘钟山红’。【结论】推测该基因异常表达与‘钟山红’葡萄雌能花形成有关。     

白菜细胞核雄性不育基因向菜心品种早-49的转育研究

根据大白菜复等位基因遗传假说,利用现有白菜雄性不育系(99029-2)作为不育源,以早-49菜心品种为目标亲本,经过杂交、自交、测交、兄妹交等转育方法,将核不育基因向菜心品种转育,得到了含有早-49遗传基因的新甲型两用系、临时保持系和雄性不育系。     

大白菜细胞核隐性雄性不育系恢复基因BrMf2的标记及定位

[目的]筛选大白菜细胞核隐性雄性不育(RGMS)育性基因(Mf)的连锁标记,通过定位该基因,为克隆雄性不育基因打下基础.[方法]939A不育系与YQD56A杂交F1S4后代为试材,利用混合分组分析法(BSA),应用SRAP和SRAP-AFLP标记技术筛选引物1 256对.[结果]获得与大白菜细胞核隐性雄性不育恢复基因连锁的标记2个,PM8K4和Me2M49,与恢复基因的遗传距离分别为2.98 cM和10.92 cM.通过调查PM8K4标记在大白菜DH作图群体中的多态性,将该基因定位在A8连锁群,即大白菜第9染色体.[结论]标记PM8K4可以在苗期对大白菜细胞核雄性不育性状进行标记辅助选择.