雷公藤生物碱制品对非靶标生物的毒性研究

安全性评价是新农药开发及应用的重要基础。参照国家环保总局和农业部农药检定所制定的《化学农药环境安全评价试验准则》,测定了95%雷公藤总生物碱、1.0%雷公藤生物碱微乳剂、雷公藤乙醇浸膏和助剂系统对生态环境中非靶标生物的毒性。结果表明:95%雷公藤总生物碱对鹌鹑为高毒,对蜜蜂、家蚕为中毒,对鲤鱼、蚯蚓、蝌蚪均为低毒;1.0%雷公藤生物碱微乳剂对蝌蚪为高毒,对鹌鹑和家蚕为中毒,对鲤鱼、蜜蜂和蚯蚓均为低毒;雷公藤乙醇浸膏对鹌鹑为中毒,对蜜蜂、家蚕、鲤鱼、蚯蚓和蝌蚪均为低毒;助剂系统对供试生物均为低毒。由此可见,雷公藤生物碱制品对环境生物较为安全,但在桑园和水田附近慎用,并应注意对鸟类的保护。     

雷公藤生物碱制品对小菜蛾和菜青虫的控制效果

测定了雷公藤总生物碱对小菜蛾和菜青虫的室内毒力,以及0.1%雷公藤生物碱乳油对两种害虫的田间防效。结果表明,雷公藤总生物碱对小菜蛾3龄幼虫48和72 h的LC50值分别为228.28和136.67 m g/L,对菜青虫5龄幼虫48和72 h的LC50值分别为307.61和238.18 m g/L;1.0%雷公藤生物碱乳油对小菜蛾的毒杀作用较强,其48和72 h的LC50值分别为69.62和20.35 m g/L,对菜青虫48和72 h的LC50值分别为93.18和44.62 m g/L。250倍稀释的雷公藤生物碱乳油(有效含量为40 m g/L)田间喷雾处理对小菜蛾和菜青虫均具有较好的防治效果,施药后7 d的防治效果分别为82.93%和82.71%,在本试验剂量范围内对作物安全。可见,雷公藤生物碱制品对两种蔬菜害虫控制效果显著。     

雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫杀灭活性和谷胱甘肽硫转移酶的影响

【目的】研究雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫的杀灭活性、谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性以及GST相关基因表达的影响。【方法】以摇蚊4龄幼虫为试虫,分别用5,10,15μg/L雷公藤总生物碱进行处理,以用丙酮处理为对照,24~72 h后观察幼虫反应,测定雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫的致死中浓度(LC50)及谷胱甘肽硫转移酶活性,并用RT-PCR方法,检测了摇蚊11个GST基因的表达情况。【结果】雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫具有杀灭活性,24,48,72 h的致死中浓度(LC50)分别为33.019,19.092和16.760μg/L。在亚致死质量浓度(5,10,15μg/L)下,雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫谷胱甘肽硫转移酶活性具有显著的抑制作用,与同期对照相比,酶活性最大下降幅度分别为73.49%(以1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)为底物)和73.20%(以3,4-二氯硝基苯(DCNB)为底物)。RT-PCR检测结果显示,在摇蚊11个谷胱甘肽硫转移酶基因中,有2个基因(CtGSTu3和CtGSTu4)在mRNA水平上被诱导上调表达,且mRNA表达量随着雷公藤总生物碱质量浓度的增加而升高,存在着剂量依赖关系。【结论】雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫具有较高的杀灭活性,有被开发为摇蚊控制剂的潜能。在亚致死质量浓度(5~15μg/L)处理下,雷公藤总生物碱能显著抑制摇蚊谷胱甘肽硫转移酶活性,并诱导CtGSTu3和CtGSTu4 mRNA上调表达。     

雷公藤甲素SD大鼠睾丸毒性体外试验研究

 探讨雷公藤甲素（Triptolide, TL）对体外原代培养SD大鼠睾丸支持细胞（sertoli cell）和生精细胞（spermatogenic cells）增殖的影响及其广谱钙粘附蛋白（Pan-cadherin）的表达。MTT法检测雷公藤甲素8种不同浓度（0,0.1,1,10,1.0×10²,1.0×10³,1.0×10⁴,1.0×10⁵ μg／L）对SD大鼠睾丸原代培养细胞增殖的影响;免疫细胞化学方法探讨在雷公藤甲素对单纯培养支持细胞的最小有毒浓度（0.1,1,10,1.0×10² μg／L）水平,培养细胞 pan -cadherin 的表达。结果表明：雷公藤甲素浓度≥10 μg／L时对混合培养细胞（主要为生精细胞）,≥1.0×10³ μg/L时对单纯培养支持细胞的增殖有明显抑制作用,均呈剂量依赖性。细胞半数抑制浓度（IC₅₀）分别为1.22 mg／L和28.15 mg／L。与溶剂对照组相比混合培养细胞在雷公藤甲素低浓度时（0.1和1 μg／L ）表达上调。雷公藤甲素低浓度即可抑制生精细胞增殖,而高浓度才能抑制支持细胞增殖,其细胞毒耐受性二者差异很大。睾丸毒性产生的原因可能与生精细胞的pan-cadherin表达上调有关。     

雷公藤生物碱乳油中雷公藤次碱和吉碱的分析测定

雷公藤次碱和吉碱是雷公藤生物碱杀虫剂的主要活性成分.试验采用高液相色谱法对雷公藤生物碱乳油中的雷公藤次碱和雷公藤吉碱进行了分析测定,色谱条件为Microsorb-100 C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈和0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液作为流动相,梯度进行洗脱1～8 min时从30∶70到100∶0,最后保持乙腈洗脱2 min,进样量10 μl,流速为1 ml/min,检测波长为254 nm,柱温为35 ℃.方法的线性相关性为0.9996～0.9998;二种生物碱的加样回收率分别为98.9%,99.8%,RSD分别为0.86%,0.54%.     

雷公藤总生物碱对二化螟的生物活性

研究了雷公藤总生物碱对二化螟的生物活性。结果表明，雷公藤总生物碱对二化螟幼虫有较强的拒食作用、生长发育抑制作用和毒杀作用。在选择性和非选择性的条件下，雷公藤总生物碱对二化螟三龄幼虫拒食中浓度（AFC50）分别是217．2和46．1mg／L；对初孵幼虫的拒食中浓度（AFC50）分别是188．3和22．5mg／L。浓度为25mg／L时，雷公藤总生物碱对二化螟幼虫生长发育抑制率为26．72％；100mg／L时为88．79％。雷公藤总生物碱对二化螟幼虫的毒杀作用也比较明显，但作用缓慢，处理24h和48h后的LC50分别为676．4和326．5mg／L。     

碎米莎草根部总生物碱的化感活性及抑菌活性的研究

以水稻等5种植物和水稻稻瘟病等6种植物病原真菌为试验对象,通过生物测定的方法对碎米莎草根部总生物碱的化感活性及抑菌活性进行初步研究.结果表明:在250～4 000 μg/mL质量浓度内,总生物碱对水稻和鳢肠种子的萌发无显著影响,对烟草幼苗的苗高产生显著抑制作用;只有在最高质量浓度达到4 000 tw/mL时,总生物碱对水稻幼苗的根长、苗高和鲜重以及鳢肠幼苗的苗高才有显著抑制作用,而在相对较低浓度下,总生物碱即对烟草、车前草和三叶鬼针草幼苗的鲜重、根长和苗高以及鳢肠幼苗的鲜重和根长产生显著抑制作用.在25～400 μg/mL,质量浓度内,碎米莎草根部总生物碱对小麦赤霉病病菌的生长无显著影响,在100～400 μg mL质量浓度范围内,对油菜茵核病病菌菌落的生长产生显著抑制作用,在200～400 μg/mL质量浓度内对水稻稻瘟病病菌、番茄早疫病病菌和苹果轮纹病病菌菌落的生长产生显著抑制作用,对杨树溃疡病病菌菌落的生长只有在400μg/mL的最高质量浓度下才产生显著抑制作用,在400 μg/mL质量浓度时,碎米莎草根部总生物碱对上述后5种病原真菌的抑菌率分别为40.10%、20.54%、30.63%、34.82%和12.08%.实验结果可以看出,碎米莎草根部总生物碱对水稻种子萌发和幼苗生长的抑制作用较弱,而对水稻稻瘟病病菌的生长具有一定的抑制作用,表明其具有开发为水稻田用生物源农药的潜力.     

美地那活化剂对土壤微生物呼吸作用的影响

采用直接吸收法,研究了美地那活化剂对土壤微生物呼吸的影响。结果表明:40和100μg/g美地那活化剂对土壤呼吸作用有抑制作用,4和10μg/g美地那活化剂对土壤微生物活性有促进作用;美地那活化剂在土壤中作用2周后,微生物活动加强;在大田正常使用浓度范围内,美地那活化剂对土壤微生物呼吸有促进作用,能调节植物生长。     

雷公藤总生物碱分离及杀虫活性研究

提取、分离了雷公藤 (Tripterygium wilfordii Hook)根皮中总生物碱 ,并对其杀虫活性和作用方式进行了系统的生物测定。结果表明 ,雷公藤总生物碱对 5龄菜青虫有很强的麻醉、拒食和毒杀作用 ;拒食中浓度AFC5 0 为 2 75 .5 3m g/L,毒杀中浓度 L C5 0 为 77.86 m g/L,麻醉中量 ND5 0 为 2 .2 9μg/g;雷公藤总生物碱无触杀和熏蒸作用。试虫中毒症状主要为幼虫表皮出现黑斑 ,形成黑斑部分不能脱去旧表皮 ,最终死亡     

雷公藤生物碱的土壤环境行为研究

【目的】评价雷公藤生物碱在土壤中的环境行为,为推动该植物源杀虫剂的开发和应用提供依据。【方法】参照《化学农药环境安全评价试验准则》(中华人民共和国农业部),采用土壤吸附和土柱淋溶试验,研究雷公藤生物碱在3种土壤(东北黑土、河南二合土和关中土娄土)中的吸附性能;采用土壤降解试验,以灭菌和未灭菌的桃园、小麦田、甘蓝田土壤为研究对象,检测了雷公藤生物碱在不同土壤中的降解性能。【结果】雷公藤生物碱在东北黑土、河南二合土及关中土娄土上的吸附性能可以用Freundlich平衡方程进行拟合,其在以上3种土壤中的吸附常数Kd分别为15.21,8.62和11.05,均属较难吸附,也难淋溶。在未灭菌的桃园土壤、小麦田土壤及甘蓝田土壤中,雷公藤生物碱的降解半衰期分别为10.06,9.92和8.88d,均属易降解;而在灭菌的上述3种土壤中,雷公藤生物碱降解较慢,处理32d后的降解率分别为49.71%,30.82%和33.33%。【结论】雷公藤生物碱在土壤中难移动、降解快,对土壤环境较为安全。     

雷公藤hmgr基因克隆、序列分析及诱导表达

【目的】克隆雷公藤萜类生物合成途径限速酶HMGR的编码基因,并分析雷公藤叶悬浮细胞中该基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达水平,为雷公藤萜类生物碱的生物合成提供理论依据。【方法】根据GenBank中报道的限速酶HMGR的编码基因序列合成简并引物,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE方法从雷公藤叶片中获得hmgr基因的cDNA全长序列;用生物信息学方法对限速酶HMGR进行蛋白结构及功能分析;用半定量RT-PCR方法比较hmgr基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达差异;用HPLC分析不同质量浓度壳寡糖诱导下雷公藤叶悬浮细胞中3种萜类次生代谢物(内酯醇、吉碱和次碱)的含量。【结果】获得了雷公藤中编码限速酶HMGR的基因全长cDNA序列,该序列开放阅读框长为1 860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析表明,雷公藤hmgr基因编码的蛋白分子质量为61.678ku,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,氨基酸序列包含2个与NADPH结合的位点(DAMGMNM和VGTVGGGT)及2个与HMG-CoA结合的位点(EMPVGYVQIP和TTEG-CLVA)。半定量RT-PCR结果表明,经50mg/L壳寡糖诱导12h的雷公藤叶悬浮细胞中hmgr基因表达最强,且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高。【结论】雷公藤HMGR蛋白可能为甲羟戊酸(MVA)途径中的限速酶,编码该蛋白的hmgr基因可促进雷公藤萜类物质的合成。     

具杀虫活性雷公藤内生菌的分离与筛选

以卫矛科植物雷公藤的根、茎、叶为材料分离得到内生菌183株,其中真菌111株,放线菌23株,细菌49株。雷公藤植株的不同组织部位的内生菌数量有较大的差异,雷公藤根中分离得到的内生菌最多(89株),占总数的48.63%,叶部次之(72株),占总数的39.35%,茎部分离得到的内生菌最少(22株),占总数的12.02%。以卤虫、蚊幼及蚜虫为试虫,对183株内生菌的杀虫活性进行筛选,得到3株对蚜虫具有较高毒杀活性的菌株。其中菌株11-6-76的胞内和胞外代谢物均具有较高的杀蚜活性,蚜虫的死亡率分别为78.64%和70.75%;菌株11-3-37和12-2-47的胞内代谢产物提取物对蚜虫的毒杀活性较高,蚜虫死亡率分别为82.74%和76.97%。菌株11-3-37、11-6-76和12-2-47胞内代谢产物粗提物对蚜虫的LC_(50)分别为34.8mg/mL、31.2mg/mL和46.4mg/mL。     

雷公藤生物碱在水体中的降解

为推动植物源雷公藤杀虫剂的开发及应用,参照国家环保总局和农业部农药检定所制定的《化学农药环境安全评价试验准则》,对雷公藤生物碱在水体中的降解进行研究。结果显示,雷公藤生物碱在pH 9.0水体中的半衰期分别为5.18d(50℃)和14.20d(25℃),在河水中的半衰期分别为5.65d(50℃)和20.03d(25℃),在池塘水中的半衰期分别为5.19d(50℃)和12.65d(25℃),均属易水解。可见,雷公藤生物碱杀虫剂对水环境较为安全。     

QuEChERS/UPLC-MS/MS法测定雷公藤及根际土壤中3种农药残留

为建立雷公藤种植过程中常用农药的残留含量检测方法,采用快速样品前处理结合超高效液相色谱-串联质谱法（quick,easy, cheap,effective,rugged and safe/ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,QuEChERS/UPLC-MS/MS）测定雷公藤及根际土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素的含量。样品中加入适量的水浸润后用乙腈超声提取,N-丙基乙二胺（PSA）吸附净化,利用优化后的UPLC-MS/MS方法进行检测,基质外标法定量。结果显示,3种农药在根样基质中的检出限（LOD）为0.001～0.714μg/kg,定量限（LOQ）为0.002～2.380μg/kg;在土壤基质中的检出限（LOD）为0.002～0.810μg/kg,定量限（LOQ）为0.006～2.410μg/kg。线性关系、回收率和相对标准偏差均符合农药残留检测的相关规定。结果表明,该方法能满足雷公藤及根际土壤中3种农药残留含量的快速检测要求。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

苏州近郊4种不同森林群落稳定性研究

稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林＞冬青湿地松林＞栎树湿地松林＞木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

干旱胁迫下不同品种小麦4种功能基因的表达模式及相关生理指标分析

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。