柽柳cpSSR-PCR反应体系的建立和优化

[目的]建立并优化柽柳cpSSR-PCR反应体系和反应条件。[方法]对影响PCR反应的5个变量(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度)进行L_(16)(4~5)正交试验设计,并对引物退火温度进行梯度筛选。[结果]最优反应体系:Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.25 U、引物0.25μmol/L、模板DNA 20 ng,共10μL。反应程序:94℃预变性4 min;94℃30 s,引物退火温度30 s,72℃30 s,30个循环;72℃延伸10 min。[结论]该反应体系成功扩增1个柽柳天然群体的23个个体,为柽柳群体扩散路线的确定奠定基础。     

木槿ISSR-PCR反应体系的建立及优化

建立木槿ISSR-PCR反应体系,为木槿种质资源的创新与鉴定提供理论基础。采用正交试验法,对影响PCR结果的Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量及引物浓度5个因素进行分析,采用单因素试验对退火温度进行筛选,并利用最佳体系对24个木槿品种进行扩增验证。结果表明,最优反应体系(25μL)中,含10×buffer(Mg~(2+) free) 2.5μL、Taq酶0.75 U、Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物0.5μmol/L。PCR反应程序为94℃预变性2 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸6 min,4℃保温。建立的体系对24个木槿品种能够扩增出清晰稳定、无拖带、多态性高的条带。     

大头典竹ISSR反应体系建立与优化

以大头典竹叶片为材料,采用单因素分析法和正交设计直观分析法,对影响PCR扩增效果的Mg~(2+)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA含量这5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行筛选。通过研究建立了适合大头典竹的ISSR-PCR反应体系:20μL反应液中含2.5 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L dNTPs,1.25 U TaqDNA聚合酶,0.6μmol/L引物,10 ng模板DNA,2μL 10×Buffer,10.55μL ddH_2O。相应反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性45 s,54.5℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。应用建立的优化反应体系成功地筛选出16条多态性较高的引物,表明该体系具有较高稳定性、重现性、适用性,可较好地应用于大头典竹不同地理种源间的遗传多样性研究。     

春兰ISSR-PCR反应体系的优化

以春兰为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模板DNA、dNTPs、MgCl2、primer、TaqDNA聚合酶的浓度及引物退火温度、反应循环数进行了探讨,确立了适合春兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数:在15μL反应体系中含1×buffer,0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.3 UTaqDNA聚合酶,20 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2.5 min;94℃变性45 s,48~58℃退火(退火温度随引物不同而定)45 s,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸5 min。     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

玉米自交系SSR技术反应体系的优化

以玉米自交系为材料,研究了PCR反应体系的Mg(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度及退火温度对玉米自交系SSR扩增结果的影响,确定适合玉米自交系SSR分子标记研究的优化体系.最终确定总反应体系为20μmol/L,Mg(2+)浓度3.0mmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.45μmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 50ng.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1 min,35个循环;最后72℃5 min.     

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心(Brassica campestris L. ssp. Chinensis Var. utilis Tssen. et Lee.)为材料, 对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg2 、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨, 确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数 在25 μL反应体系中含10×buffer 2.5μL, 2.0 mmol/L Mg2 , 0.5 U Taq DNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L引物, 30 ng模板DNA. PCR扩增程序 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min, 49.7～56 ℃退火(退火温度随引物不同而定)1 min, 72 ℃延伸45 s, 40个循环; 72 ℃延伸5 min.     

南瓜SRAP扩增体系与扩增程序的优化

利用L45正交设计对影响南瓜SRAP反应体系的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq酶含量、引物浓度及模板DNA浓度等5个因素进行了筛选,快速得到稳定性和重复性好的南瓜SRAP扩增体系。对复性温度、PCR循环次数等影响南瓜SRAP扩增结果的重要因素进行了优化。最终优化的南瓜SRAP反应体系为25μL反应液中:10×buffer2.5μL,0.2 mmol/L dNTPs,引物0.2μmol/L,1.5 mmol/LMgCl2,DNA模板6 ng/μL,Taq酶1.5 U。本研究最终确立的PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,35℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行5个循环,94℃变性40 s,50℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行32个循环,最后72℃延伸5 min。在此条件下得到的SRAP标记可为南瓜遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究提供稳定有效的手段。     

花吊丝竹ISSR反应体系的建立与优化

建立关于花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系,为花吊丝竹种质资源鉴定提供理论基础。采用单因素试验法,对影响PCR扩增效果的Mg~(2+)浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行分析,并利用建立的优化反应体系和扩增程序对100条候选引物进行筛选。结果表明,适合花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系为:20μL的反应液中含3.0 mmol/L Mg~(2+)、0.20 mmol/L d NTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6μmol/L引物、10 ng模板DNA、2μL 10×Buffer、8.55μL dd H_2O。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。建立的花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系能够扩增出清晰、多态性较高的条带,且筛选出的16条引物具有高度多态性。表明该体系具有较高的稳定性、重现性和适用性。     

大葱RAPD反应体系的优化

研究了大葱基因组DNA的提取方法,并对Mg2 浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了RAPD最佳反应体系,即20μl反应体系中10×Buffer缓冲液2μl,Mg2 浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度0.22 mmol/L,引物浓度0.65μmol/L,Taq酶1 U(2.5 U/μl),模板DNA 60 ng,用灭菌超纯水补足20μl。扩增程序为:94℃预变性3 m in;94℃变性40 s,38℃退火45 s,72℃延伸1 m in,40个循环;最后72℃延伸10 m in。     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

旨在构建胡椒(Piper nigrum L.)基因组DNA的ISSR-PCR反应体系,以便为海南胡椒属植物的遗传多样性分析研究打下基础。利用单因素随机试验设计,对胡椒ISSR-PCR反应体系中各组分(TaqDNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、引物和Mg2+)的浓度进行优化,同时筛选ISSR-PCR反应的循环数和最适退火温度。确定了最优的ISSR-PCR反应体系为:总体积20μL,其中Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTPs 0.8 mmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.8 mmol/L,模板DNA 50 ng。同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度及最佳循环数。胡椒ISSR-PCR最佳反应程序为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,54.9℃(引物834)退火30 s,72℃延伸45 s,共计35个循环,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存。这一反应体系可成功地应用于海南胡椒属植物的遗传多样性分析。     

桑树SSR-PCR反应体系的优化

为了建立经济稳定的桑树简单重复序列(SSR)-PCR反应体系,为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础,采用L_(16)(4~5)正交试验设计和单因素试验,对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度和rTaq酶用量5个因素的4个水平进行优化分析,并比较这5个因素的不同浓度对扩增效果的影响。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为Mg~(2+)、dNTPs引物模板DNArTaq酶。研究最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含有1.5μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4μL 25 mmol/L Mg~(2+)、0.5μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15μL 20μmol/L正反向引物、0.1μL 5 U/μL rTaq酶和1μL 10×loading buffer。通过稳定性检测,表明该体系能够用于桑树的SSR分析。     

黄皮RAPD-PCR反应体系的优化

以5′-GTCGTTCCTG-3′为随机引物,以酸黄皮为试材,对黄皮RAPD反应体系进行了优化研究,结果表明:20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶、Mg2 、随机引物、模板DNA和dNTPs 5种主要成分的适宜浓度和用量分别为2.0 U、2.5 mmol/L、0.5 umol/L、50 ng、0.20 mmol/L。适宜的扩增程序为94℃预变性3 min,1个循环;94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸1 min,38个循环;72℃后延伸7 min。     

洋葱Ms位点多重PCR标记的开发与优化

以本课题组已获得的洋葱Ms位点侧翼序列为基础,设计、筛选引物获得了一个兼容的多重PCR分子标记,并对其反应体系和反应程序进行了优化。优化后的扩增体系:10×PCR buffer(Mg2+free)2.5μL、25 mmol/L MgCl24μL、2.5 mmol/L dNTP 6μL、DNA模板1μL(约50 ng)、10μmol/L引物各1μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6μL、用灭菌双蒸水补齐至25μL;反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,65.4℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。优化后的体系和程序可以检测到清晰的目的条带,通过一次PCR反应即可鉴定Ms位点的3种基因型(MsMs、Msms、msms),操作简单,稳定性好。     

福建含笑ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以福建含笑叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于福建含笑ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μL PCR反应体积中含0.4 mmol.L-1dNTPs,2.5 mmol.L-1Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,0.6μmol.μL-1引物,30 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,47.3℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸7 min,4℃保存。应用ISSR体系对5份福建含笑种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

绿竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对dNTPs、Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA设置7个不同浓度梯度进行研究,并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,dNTPs浓度为0.2 mol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA用量为50 ng,10×PCR buffer体积为2μL、剩余体积用灭菌dd H2O补全。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次;72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。本研究建立了绿竹ISSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为绿竹的指纹图谱、遗传多样性分析、分子育种和品种鉴定等研究提供了基础。     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min。     

土壤微生物总DNA的V_3可变区PCR反应体系优化

为了优化以土壤微生物DNA为模板的PCR反应条件,采用E.Z.N.A.soil DNA kit试剂盒提取土壤微生物总DNA,对16SrDNA V3可变区的PCR反应体系和反应条件进行优化。主要从DNA模板用量、引物浓度、退火温度、热启动方式4个方面进行筛选试验,最后得出最适宜的土壤DNA扩增体系为:10.5ng模板DNA、5μL 10×buffer、4μL 2.5mmol/L dNTP、10μmol/L引物各1.5μL,2.5UTaq酶,加无菌ddH2O补足至50μL;PCR循环程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸70s,29个循环;72℃延伸5min。试验结果表明:选择热启动方式和合适的退火温度是获得高质量PCR产物的关键。     

枣树基因组DNA提取及其RAPD体系优化

以不同生长期的枣和酸枣为研究对象,采用CTAB法提取枣基因组DNA;通过单因素5水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了枣和酸枣RAPD技术最优体系,即25μl反应体系中各组分含量为10×Taq Buffer+KCl 2.5μl;Taq DNA聚合酶0.04 U/μl;MgCl22.0 mmol/L;模板DNA2 ng/μl;引物0.3μmol/L;dNTP为0.2 mmol/L。适宜的扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃循环变性50 s,36℃退火50 s,72℃延伸1.5 min,38个循环;72℃延伸10 min。     

巨竹ISSR反应体系的建立与优化

以巨竹叶片提取的基因组DNA为材料,用引物UBC810(序列为GAG AGA GAG AGA GAG AT)研究了PCR反应体系的主要成分、退火温度及循环次数对该种植物ISSR扩增结果的影响。结果表明,20μL的反应体系含40 ng模板DNA、0.6μmol.L-1引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,2.5 mmol.L-1Mg2+,0.25 mmol.L-1dNTPs,1×Buffer。PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,54.5℃复性30 s,70℃延伸90 s,循环40次;72℃延伸10 min,置4℃保存。