球孢白僵菌原生质体获得和再生恢复培养条件的研究

对球孢白僵菌菌龄、β-巯基乙醇、溶壁酶、渗透压稳定剂和琼脂粉含量等条件对球孢白僵菌原生质体的获得和再生恢复培养的影响进行了研究,建立了球孢白僵菌原生质体获得和再生恢复培养的最佳体系。原生质体获得的最佳菌龄为培养24~28 h的菌丝体,最佳β-巯基乙醇浓度为0.01 mol/L,最佳酶为真菌溶壁酶,最佳渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaCl,原生质体获得频率高达99%;原生质体再生恢复时培养基中最佳渗透压稳定剂为0.7 mol/L葡萄糖,最佳琼脂粉质量分数为0.75%,再生频率达57%。     

绿粘帚霉原生质体制备和再生条件的研究

采取单因素实验对绿粘帚霉(Gliocladiu mvirens F051)的原生质体制备和再生条件进行了研究,结果表明,绿粘帚霉(F051)原生质体制备和再生的最佳条件是:用培养基A培养F051分生孢子24h,MgSO40.6mol/L(再生用蔗糖0.6mol/L),磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为缓冲系统,纤维素酶:蜗牛酶:溶菌酶=4mg/mL∶2mg/mL∶2mg/mL,在32℃水浴中酶解2h。     

层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据.     

顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究

对头孢菌素C的工业生产菌种顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)原生质体形成和再生条件进行了研究。优化后的制备及再生条件为:在蛋白胨固体培养基上培养110~120 h的菌丝体,30℃条件下经1%蜗牛酶和1%纤维素酶混合液酶解3.5 h,原生质体得率最高可达2.377×107个/mL;在以KC(0.6 mol/L KCl+25mmol/L CaCl2.2H2O)为渗透压稳定剂的再生培养基上进行培养,再生率可达40%。用pMK4-LV质粒通过电击法对原生质体进行转化,成功得到了重组子,转化率约为10个转化子/μg质粒DNA。转化子的PCR鉴定结果表明,外源基因已转入顶头孢霉基因组。     

蛹虫草原生质体的制备和再生研究

研究了不同渗透压稳定剂、酶的种类及浓度、温度、pH、β-巯基乙醇预处理等条件对蛹虫草原生质体制备的影响,以及不同培养基对原生质体再生的影响。结果显示蛹虫草菌株原生质体的最佳制备和再生条件为:0.7 mol/L氯化钠作为渗透压稳定剂,纤维素酶5 mg/dL、蜗牛酶5 mg/dL、溶菌酶5 mg/dL、溶壁酶10μL混合酶解6 h,酶解温度为30℃,最佳pH 5,再生培养基为PDA(添加0.7 mol/L氯化钠)。     

降解多菌灵木霉Tr1原生质体制备及再生条件研究

研究可降解多菌灵的木霉菌株Tr1的原生质体制备及再生的适宜条件,发现该菌原生质体制备的最佳条件为菌龄20 h,裂解酶液为5 mg/m L的溶菌酶和蜗牛酶的混合酶液,二者使用前按照体积比2∶1混合,酶解温度30℃,50 r/min缓慢振荡酶解2.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol/L KCl,原生质体产量达6.44×106个/m L。原生质体再生的优化条件为:PDA为培养基,添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L环己六醇作为渗透压稳定剂,采用双层固体培养方式,有助于原生质体的再生。     

一株产紫杉醇真菌PM-1菌株的原生质体制备条件研究

在探明小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)PM-1菌株产生紫杉醇的基础上,本试验系统研究了菌龄、孢壁降解酶、稳渗剂、酶解时间及温度和培养基初始pH值对小孢拟盘多毛孢PM-1菌株原生质体制备和再生的影响,以期建立稳定高效的原生质体制备和再生体系。研究发现,小孢拟盘多毛孢PM-1菌株原生质体制备受多种因素影响,其中主要因素为混合酶系中各种酶的浓度配比及酶解时间,综合各项试验结果,明确PM-1菌株原生质体制备适宜的条件为分生孢子悬浮液接种Fries液体培养基(pH5.5)振荡培养18h,Lywallzyme(7.5g/L)、Drislase(7.5g/L)、Snailase(7.5g/L)3种酶的混合溶液,在36℃下酶解3h,以0.7mol/L NaCl作为稳渗剂制备的原生质体产量最高。研究结果为菌株的遗传改良和提高菌株的紫杉醇产生率奠定了基础。     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

秦巴蛹虫草原生质体的制备及再生条件研究

【目的】研究秦巴蛹虫草原生质体制备及再生的最适条件,建立高效制备和再生原生质体的方法。【方法】以秦巴蛹虫草无性型菌株CM-16为材料,研究细胞壁裂解酶种类、酶解时间、酶解温度、菌丝体菌龄及稳渗剂种类对原生质体制备及再生效果的影响,并在单因素试验结果基础上进行正交优化试验。【结果】(1)以0.6mol/L NaCl为稳渗剂,用混合酶(质量分数1%纤维素酶和质量分数0.5%蜗牛酶按1∶1体积比混合)在(26±1)℃对菌龄6d的菌丝酶解3h,原生质体的产量最高。(2)以0.6mol/L甘露醇为稳渗剂,用混合酶(质量分数1%纤维素酶和质量分数0.5%蜗牛酶按1∶1体积比混合)在(26±1)℃对菌龄5d的菌丝酶解2h,原生质体的再生率最高;验证试验结果表明,在此条件下,原生质体再生率平均为25.7%,此时原生质体平均产量为83.42×105 mL-1。【结论】对酶解温度、酶解时间、菌丝体菌龄、稳渗剂及酶系种类等条件的优化,可提高秦巴蛹虫草原生质体的产量及再生率。     

产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备与再生

以产紫杉醇内生真菌XT5为供试菌株, 研究了酶系组成、酶解时间、酶解温度、菌体培养方式、菌龄等因素对产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备和再生的影响. 结果表明: 将内生真菌XT5在PDA液体培养基中静止培养12～16 h, 离心收集菌体, 用0.7 mol/L的NaCl配制成的含有2%纤维素酶+1%蜗牛酶的复合酶, 32 ℃恒温酶解2 h, 原生质体制备率最高;以上述条件酶解1.5 h左右, 采用双层平板培养法于32 ℃再生, 获得的原生质体再生率最高为12.4%.     

甘蓝型油菜子叶原生质体培养及植株再生研究

以甘蓝型油菜中双6号子叶为材料制备原生质体,采用固液结合培养,探讨了其原生质体分离、培养与再生的优化条件,获得了再生植株。结果表明:混合酶液(0.5%纤维素酶+0.1%果胶酶+0.2 mol/L甘露醇+80 mmol/L CaCl2)与SCM溶液按3∶7的比例混合,酶解14 h可获得高产率中双6号子叶原生质体;原生质体在前人设计的B、C固液相结合培养基上培养效果好;最佳分化培养基为E培养基+1.0 g/L 6-BA+0.1 g/L NAA+0.02 g/L GA3+30μmol/L AgNO3;所有再生芽均在无激素的MS培养基上生根。研究结果为建立成熟的甘蓝型油菜原生质体再生体系提供了新的配方与依据。     

绿色木霉 X-13株固态发酵产酶优化条件的研究

 对绿色木霉X-13株固态发酵产纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶的优化条件进行了研究;通过综合评分的决策方法分析表明,X-13株的产酶优化条件是:稻草粉与麸皮的比例1.5∶1,料水比1∶1.5,氮源是2.0%～2.5%硫酸铵,培养基起始pH值6.0～6.5,250 mL三角瓶中装培养基15～20 g,培养时间60 h;以0.01 mol/L,pH 7.4 PBS于室温下浸提发酵培养基2 h,所得粗酶液活性最高。     

L-乳酸生产菌——根霉菌的原生质体化及再生条件的研究

对米根霉AS3 .82 0及少根根霉AS3 .2 893进行了原生质体化及再生条件的研究。它们原生质体化及再生的最佳条件为 :米根霉AS3 .82 0 :蜗牛酶、溶菌酶与纤维素酶之比为 2∶1∶2 ,酶浓度为 2mg/mL ,在 3 0℃下酶解 3h ;少根根霉AS3 .2 893 :蜗牛酶、溶菌酶与纤维素酶之比为 3∶1∶1 ,酶浓度为 1mg/mL ,在 3 0℃下酶解 3h。稳定缓冲液为含 0 .7mol/LKCl的 0 .0 5mol/L的磷酸缓冲液 (pH为 6.0 )。在上述条件下 ,原生质体产量可达 1 .7× 1 0 6～ 2 .0× 1 0 6 个 /mL。     

欧洲黑莓的染色体观察

以组培苗根尖和茎尖为材料,明确了适合欧洲黑莓优良品种‘冬福瑞’(Rubus fruiticosusvar.‘Thorn-free’)染色体观察的去壁低渗法主要条件参数,即:根尖在0.02%秋水仙素和2 mmol/L的8-羟基喹啉混合液(1∶1)中预处理2 h,用2.5%的纤维素酶和果胶酶混合液(1∶1)酶解去壁2 h,后低渗30 min,以确定冬福瑞染色体数。确定了欧洲黑莓‘冬福瑞’为四倍体,染色体数目为28。     

银白杨叶片不定芽再生影响因素的研究

该文以银白杨无菌试管苗叶片为外植体 ,进行了不同培养基及不同因子对银白杨叶片不定芽诱导的研究 ,建立了叶片不定芽再生植株体系 ,为今后的遗传工程改良奠定了基础 .结果表明 :银白杨叶片不定芽诱导的最适培养基是MS附加 6 BA和NAA(5∶1) (即MS +6 BA 0 5mg L +NAA 0 1mg L +蔗糖 2 5 % +琼脂 0 5 5 % ,pH 5 8) ,不定芽再生率达 95 %以上 ;当 6 BA NAA <5时 ,叶片不定芽再生率和再生系数均降低 ,当 5≤ 6 BA NAA≤ 30时 ,随着比值的增大 ,不定芽再生率明显下降 ,不定芽再生系数也减少 ;叶片不定芽再生能力强的最佳取材位置是自试管苗顶端向下伸展叶的第 1～ 3片叶 ;生根试管植株叶片的不定芽再生能力强于无根试管植株 ;叶片不定芽诱导的最佳光照时间为每天 14h .     

酸性条件下甘草苷及异甘草素提取工艺的优化

[目的]优化甘草苷及异甘草素的提取工艺。[方法]以2种甘草总黄酮提取物为原料,在酸性条件下用超声波提取甘草苷及异甘草素;采用正交设计优化2种成分的提取工艺;利用HPLC法检测其含量。[结果]原料Ⅱ是提取甘草苷及异甘草素的较优材料,甘草苷的最佳提取条件：酸浓度为0.5 mol/L,超声提取时间为1.5 h,提取温度为70℃,料液比为1∶20;异甘草素的最佳提取条件：酸浓度为2.0 mol/L,超声提取时间为1.5 h,提取温度为70℃,料液比为1∶10。[结论]该工艺简单、易行,重复性好,适合甘草苷及异甘草素的工业化提取。     

二色茉莉组织培养技术体系研究

以茎段为材料,采用不同培养基,研究确定适合二色茉莉(Brunfelsialatifolia)组织培养的培养基类型,植株再生的可能途径,以及适宜的培养条件。结果表明:①培养条件为温度25±2℃,光照强度1500～2000lx,光照12h/黑暗12h;②初代培养以MS+BA1 0mg/L+NAA0 01mg/L为最佳组合配方;③接种后直接进行光照培养启动较快;④0 1%升汞对外植体处理时间6min效果最好,启动率达91 5%,污染率2 5%;⑤继代培养以MS+BA2 0mg/L+NAA0 05mg/L为好,其月增殖系数为6 11,丛生芽多且生长适中,30d便可增殖一代;⑥生根培养以1/2MS+IBA2 0mg/L为好,其生根率为93 3%,平均根数为2 85条,平均根长为2 52cm;⑦生根移栽到珍珠岩∶蛭石=1∶1的育苗基质中,30d后成活率为85 9%。     

茶薪菇原生质体制备条件的分析

以茶薪菇为出发菌株,对其原生质体制备条件进行研究,具体分析了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解时间和温度等因素对茶薪菇原生质体产出量的影响。结果表明:采用液体发酵培养第5 d的菌丝体,以0.4 mol/L KC l作渗透压稳定剂,加入0.20%混合酶(纤维素酶与蜗牛酶按1∶1混合)在25℃下酶解3 h,制备原生质体效果最佳,原生质体产出量可达2.5×107个/mL。