疣粒野生稻原生质体再生小植株

 以我国特有的疣粒野生稻成熟胚和幼穗作外植体诱导愈伤组织 ,挑选致密颗粒状愈伤组织建立胚性细胞悬浮系并分离原生质体 ,将原生质体固体包埋后添加液体培养基进行培养。在培养过程中调节培养体系渗透压诱导产生胚状体 ,成功得到疣粒野生稻的原生质体再生植株 ,对提高原生质体再生频率的途径进行了探讨。     

橄榄成熟胚培养研究

以橄榄常见品种惠圆的成熟胚为外植体，研究橄榄成熟胚培养的方法、培养反应和影响因素。建立了橄榄成熟胚离体无菌培养的有效方法；获得了橄榄无菌胚苗、愈伤组织、气生根和胚状体等4种培养物，为进一步的橄榄离体快速繁殖、细胞悬浮培养、原生质体培养、遗传转化以及离体种质保存等生物技术研究奠定基础。     

紫外线灭活的原生质体作为饲养层培养柑橘原生质体的研究

使用紫外线(UV)照射来源于柑橘愈伤组织的原生质体,使之灭活后,作为饲养层培养目标原生质体.结果表明,UV照射的原生质体作为饲养层能促进来源于愈伤组织的原生质体的生长,而对叶肉原生质体的生长无促进作用.本研究建立的培养方式可用于柑橘融合产物培养或低密度原生质体培养,也可为其他作物的原生质体培养作参考.     

浮萍原生质体瞬时表达体系的建立及其应用研究

【目的】建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程。【方法】采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法。利用农杆菌介导外源基因进入浮萍愈伤组织,并制备原生质体观察瞬时表达情况,通过对农杆菌种类、菌浓度、乙酰丁香酮浓度及共培养时间等参数进行调整,筛选最佳的浸染条件。最后利用该瞬时表达体系进行亚细胞定位研究和启动子功能验证。【结果】原生质体制备的最佳条件为:以4℃过夜培养的浮萍悬浮培养愈伤组织为制备材料,用酶液(2%纤维素酶、0.5%离析酶、0.5%果胶酶、0.1 mol/L CaCl_2、0.2 mol/L KCl、1%BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25℃避光消化16 h(40 r/min);农杆菌浸染最佳条件为:农杆菌GV301在菌浓度(OD_(600))为1、乙酰丁香酮浓度为100μmol/L时,浸染悬浮培养愈伤有最大转化率。【结论】成功建立了浮萍原生质体瞬时表达体系,并证明其可用于亚细胞定位和启动子功能验证等方面的研究。     

龙眼荔枝属间原生质体电融合

由龙眼的幼胚培养诱导、筛选出松散型胚性愈伤组织 ,由之建立了胚性悬浮细胞系 ;用同样的方法建立了荔枝的松散型胚性愈伤组织系 .龙眼的胚性悬浮细胞和荔枝的胚性愈伤组织在含纤维素酶和果胶酶各 10 .0g· L-1的 CPW- 13M的酶解液中酶解 ,经纯化后可得到较为纯净的原生质体 .采用电融合方法进行两种原生质体融合处理 ,获得了适宜的融合参数 ,融合率达 2 0 %以上 .融合产物经初步培养 ,形成了多细胞团     

苦瓜离体再生体系建立的研究

[目的]研究影响苦瓜离体再生体系建立的条件,为苦瓜遗传转化体系的建立奠定基础。[方法]以碧绿二号、丰绿、共和、早绿和大顶苦瓜品种无菌实生苗为试材,探讨了不同前处理、不同激素组合及培养条件对苦瓜离体形态发生的影响。[结果]播种前对苦瓜种子进行预处理能明显提高发芽率和发芽势,苦瓜愈伤组织的诱导率比较高,不受基因型和外植体种类的限制;选用上胚轴为外植体的愈伤组织发生效果较其他外植体好;12种外源激素组合中,较强分裂素类物质ZT与激动素KT组合,对愈伤组织的分化有促进作用,以MS+ZT4 mg/L+KT1 mg/L分化培养基为最佳;苦瓜愈伤组织的再分化用琼脂固化的MS培养基比液态MS培养基效果好;pH值过低或过高都不适宜愈伤组织分化,以5.8为最适。[结论]该研究为苦瓜离体再生体系的建立提供了理论基础。     

桃愈伤组织和果实瞬时转化体系的优化

【目的】为建立和优化桃愈伤组织和果实瞬时转化体系。【方法】筛选桃愈伤组织诱导的最佳外植体及培养条件,优化桃愈伤组织和离体果实进行农杆菌瞬时转化的体系。【结果】采用叶片、茎段和种胚为外植体均诱导出愈伤组织,叶片最高诱导率为85.8%,用种胚诱导愈伤可达到95.8%的诱导率,且形成的愈伤组织更松散。后续的继代培养中使用4 g/L PVP处理可以缓解愈伤组织的褐化。桃愈伤组织采用浸染液法,果块采用真空和注射法均可成功转化,不同转化方法共培养3 d为荧光检测的最佳条件。【结论】优化了桃愈伤组织的诱导条件,建立了较为稳定的桃瞬时转化体系,为桃基因的快速验证奠定了技术基础。     

不同基因型亚麻花粉小孢子离体培养研究

[目的]研究不同基因型亚麻花粉小孢子离体培养,建立亚麻花粉小孢子离体培养再生体系,以期加快亚麻单倍体育种进程。[方法]以5种不同基因型亚麻的花粉小孢子为外植体,研究不同基因型亚麻愈伤组织诱导率、绿苗的分化率的差异,筛选适宜亚麻花粉小孢子培养基。[结果]不同基因型的亚麻花粉愈伤组织的诱导率、绿苗分化率差异显著,9601和9605愈伤组织的诱导率较高,分别为30.8%和28.6%;9601组合的花粉绿苗分化频率最高为14.5%。其次为9718和9712,分化率分别为11.5%和8.0%;筛选出亚麻花粉小孢子适宜的愈伤组织诱导培养基HF1、绿苗分化培养基HF2。[结论]初步建立了亚麻花粉小孢子离体培养再生体系,为亚麻单倍体育种、突变体筛选、转基因等研究奠定了基础。     

籼稻遗传转化高频再生体系的建立

选用21个籼稻品种进行成熟胚离体培养试验，结果发现大多数品种可通过添加一定配比的外源植物激素使愈伤组织诱导率大大提高，继代培养基中添加KT NAA可明显改善愈伤组织的生长状况；连续继代可显著提高愈伤组织的再分化率；预分化培养后转入再分化培养可显著提高愈伤组织再分化率，建立了一套适于籼稻遗传转化的高频再生离体培养体系。     

转GFP基因国庆1号温州蜜柑愈伤组织原生质体的再生

对转GFP（pBIN—mGFP5-ER）基因国庆1号温州蜜柑（Citrusunshiu Mare）原生质体进行了分离、纯化和胚状体的诱导。获得的原生质体在UV下均发出明亮的GFP荧光，活性达到87％。原生质体在MA固体包埋培养基中培养至12～14d时出现第1次分裂，30d后形成针尖大小的愈伤团。培养50～60d后，再生大量直径为1～2mm左右的愈伤团。部分小愈伤团分别转移到不同碳源的培养基上诱导胚状体再生，培养2个月后，挑出的小愈伤团只长出新鲜的愈伤组织，未分化成胚状体。倍性分析显示所有再生产物均为二倍体。并对转GFP基因国庆1号在原生质体融合中的应用进行了探讨。     

骏枣叶片组织培养及植株再生技术研究

通过对骏枣叶片诱导愈伤组织、愈伤组织诱导不定芽、不定根的分化及再生植株移植的最佳条件的探讨,建立了稳定的骏枣叶片离体培养及再生植株体系.     

水稻愈伤组织生活力和寿命的研究（Ⅰ报）

水稻单细胞无性系的培养体系已经建立起来,并开始进行人工种子的研究,利用水稻原生质体也业已再生出植株。由水稻单细肥或原生质体培养诱导成植株,其中最主要的途径是经过由愈伤组织的悬浮振荡培养,游离出单细胞或由愈伤组织由用酶解离出原生质体。在这一过程中,所获得的单细胞必须是具有较强生活力和分化能力的胚性细胞。所以,愈伤组织的生活力和寿命是单细胞或原生质体培养的重要基础。关于水稻愈伤组织的生活力和寿命,国内外研究的不多。我们沈阳农业大学农学系     

野韭菜花器官脱分化影响因子研究

[目的]研究影响野韭菜花器官脱分化的诱导因子。[方法]将野韭菜花器官进行离体培养,探讨培养基种类、外源激素种类和浓度及配比、花器官不同发育时期及不同部位对愈伤组织诱导的影响。[结果]MS基本培养基最适合花蕾愈伤组织的诱导;NAA比其他生长素更有利于提高花蕾的岀愈率;花苞未开状态的花蕾愈伤组织诱导率最高;愈伤组织发生具有明显的部位效应,最好是花盘,其次是花蕾,较差是花柄,而花茎无愈伤组织发生。[结论]为建立野韭菜组织培养快繁体系奠定基础。     

枇杷原生质体培养形成愈伤组织

把茂木、尾早生、解放钟、长红等枇杷品种的心脏形至完全成熟的胚,离体培养于分别附加一定浓度植物生长调节剂的B_5,MS和改良MS(大量元素减半,简称mMS)的培养基中,诱导产生胚性愈伤组织.这种愈伤组织在添加低浓度的2,4-D的mMS培养基上产生体细胞胚.以初代和继代培养若干代的愈伤组织作为分离原生质体的材料来源.酶解液的主要成分为纤维素酶、离析酶和崩溃酶,附加0.6 mol/L的山梨醇作为渗透压稳定剂,原生质体的最高得率为1.65±0.6×10~7/g.原生质体经液体浅层培养或半固体培养4—5d后,观察到第1次细胞分裂,2周后形成小细胞团.培养2个月后,获得了愈伤组织.     

罗布麻愈伤组织原生质体分离培养

[目的]探究罗布麻愈伤组织原生质体的分离培养及其影响因素,[方法]以罗布麻无菌苗子叶与下胚轴诱导的愈伤组织为材料,研究MS培养基附加不同激素组合对原生质体分离培养的影响以及愈伤组织继代培养、不同浓度纤维素酶与离析酶组合、DPD和MS等4种培养基对原生质体产量的影响。[结果]激素组合中以6-BA0．5mg／L＋NAA0．5mg／L组合获得最高愈伤组织诱导率,达100％;用固体培养基进行继代培齐的愈伤组织的原生质体产量高于液体培养基,尤其以从继代1次愈伤组织收集的原生质体最为适宜;纤维素酶0．30％＋离析酶0．30％组合获得的原生质体产量最高,且细胞碎片较少;DPD培养基的原生质体较其他培养基的分裂得早,MS培养基的培幂效果最差,[结论]该研究为罗布麻遗传转化、突变体筛选及体细胞融合育种提供了技术途径：     

木薯脆性胚性愈伤组织原生质体培养与植株再生

【目的】建立有效的木薯原生质体再生体系,为原生质体融合以及原生质体转化等研究奠定技术基础。【方法】酶解木薯品种TMS60444 的脆性胚性愈伤组织（FEC）的悬浮系,分离原生质体的产量最高达3.5×106个/g,FDA检测其活性约90%。用TM2G培养基以液体浅层法分别在5×105个/mL和2×105个/mL密度下培养,培养过程中前30 d用0.3 mol•L-1 TM2G新鲜培养基每10 d更换1次,此后每10 d用0.25 mol•L-1 TM2G新鲜培养基更换。原生质体培养45 d后即可挑出1-2 mm大小的愈伤组织分别在MSN培养基上分化胚、CMM上促胚成熟、CEM上茎伸长、MS上生根。【结果】在5×105个/mL的原生质体培养密度下,长出的都是致密型愈伤组织（能分化胚状体）,而在2×105个/mL的密度下培养长出的有致密型愈伤组织,也有空泡型愈伤组织（不能分化胚状体）。本试验共挑出1 479个致密细胞团,分化获得757个子叶胚,已再生完整植株186棵。【结论】本研究分离的原生质体产量和活性有较大提高,对前人所指出的瓶颈问题有所改进,原生质体再生植株效率有较大提高。     

刺葡萄原生质体分离研究

为建立良好的刺葡萄原生质体分离体系,利用原生质体融合技术对刺葡萄进行品种改良,以刺葡萄叶片、根尖和愈伤组织为材料,研究了经不同酶液组合和酶解时间处理,再经过0.45μm筛网过滤,1000r/min低速离心后分离产生原生质体的情况.试验结果表明,原生质体分离材料以愈伤组织最好,叶片次之,根尖最差;4次以内继代培养的愈伤组织,经2%纤维素酶+0.5%果胶酶+1%离析酶的酶液组合酶解8h后,原生质体的产量为5.12×106个,活力为88.57%.     

不同甜橙品种胚性愈伤组织的诱导

胚性愈伤组织是柑橘利用珠心胚脱毒及原生质体融合等生物技术育种的重要材料,本研究以赣南早脐橙、纽荷尔脐橙和哈姆林甜橙不同发育时期果实的珠心胚作为外植体进行离体培养,研究不同成熟期、不同激素对3个品种未受精胚珠愈伤组织诱导率的影响,旨在建立一个高效的柑橘胚性愈伤组织诱导体系。结果表明:6-BA对柑橘愈伤组织诱导效果显著,3个品种在果实发育中期取样可以获得高质量的胚性愈伤组织,取材太早或太迟都不利于胚性愈伤组织的诱导。赣南早脐橙、纽荷尔脐橙和哈姆林甜橙诱导胚性愈伤的最佳取样时间分别为105、95和95 d,胚性愈伤率分别可达到35.90%、56.21%和65.08%。赣南早脐橙胚性愈伤组织的最佳诱导培养基是在MT培养基基础上添加7.5 mg·L^-1 6-BA,纽荷尔脐橙和哈姆林甜橙的最佳诱导培养基是在MT培养基基础上添加5.0 mg·L^-1 6-BA。     

马铃薯原生质体融合技术的研究

采用聚乙二醇（ＰＥＧ）、电融合和ＰＥＧ－电融合三种诱导融合的方法，对马铃薯双单倍体品系８２－３６和二倍体野生种Ｓｏｌａｎｕｍｍｉｃｒｏｄｏｎｔｕｍ无菌苗叶肉原生质体的融合技术进行了研究，建立了三种融合方法的适宜条件。结果表明，使用镀金平行多电极的电融合法融合效果最好，在交流场强１５０Ｖ／ｃｍ、正弦波频率１．０ＭＨＺ和直流脉冲场强１．２ＫＶ／ｃｍ、宽幅６３７．５μｓ下，施加１次脉冲，原生质体的融合频率可达３０％。在对融合细胞的培养中发现：经过异质融合处理后的原生质体形成的愈伤组织具有较强的分化能力，其中有少数愈伤组织再生出了绿色植株。     

马铃薯原生质体培养体系改良

试验以马铃薯试管苗叶片为原生质体来源，通过研究材料预处理方法对原生质体产量和质量的影响，培养方式及培养基中糖醇与细胞分裂的愈伤组织形成的关系，优化并建立了高效稳定的原生质体培养体系，获得了2个双单倍体系的叶肉原生质体再生植株。