黄花蒿法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶双功能酶基因的构建、原核表达与功能鉴定

试验将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶(法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶)的基因进行融合,经大肠杆菌表达后鉴定其融合蛋白的功能。结果表明:融合蛋白具有了双功能酶活性。双功能酶基因的构建,为进一步将双功能酶基因转入黄花蒿,提高青蒿素含量奠定了基础。     

柞蚕核型多角体病毒ptp-2基因克隆及表达

    为研究柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)ptp-2基因特性,根据ApNPV PstⅠ-C片段核酸序列,设计引物克隆了ApNPV ptp-2基因;将ptp-2基因亚克隆至原核表达载体pQE-30,构建重组质粒pQE-ptp-2,并在大肠杆菌M15中进行诱导表达,表达量达菌体总蛋白的38.7%,经His标签杂交鉴定证明表达产物为His融合蛋白.以原核表达的His-PTP-2蛋白作为抗原,制作兔多克隆抗血清,Western blot分析表明:PTP-2蛋白不参与ApNPV包涵体的结构组成.     

独行菜法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与原核表达

从独行菜(Lepidium apetalum)中克隆强心苷合成途径的法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因,并在大肠杆菌中表达,为进一步研究独行菜强心苷的合成途径提供参考。分析前期获得的独行菜幼苗转录组数据,选择其中注释为FPS且具有完整开放阅读框的序列,从独行菜叶片c DNA中通过PCR克隆该序列,并进行序列分析。结果表明,克隆得到独行菜FPS基因的cDNA序列,Gen Bank登录号KY366218,命名为La FPS。序列长度为1 332 bp,含有1 161 bp的开放阅读框,推测编码386个氨基酸。La FPS蛋白可能不含跨膜结构,定位于线粒体中,含有聚异戊二烯合成酶结构域。La FPS蛋白氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)FPS1蛋白相似性高达92%,进化树分析结果表明,La FPS与同为十字花科的拟南芥FPS1、遏蓝菜(Noccaea caerulescens)FPS1、高山南芥(Arabis alpina)FPS亲缘关系最近。构建的载体p ET-32a-La FPS可在大肠杆菌中成功诱导表达。表明成功克隆了独行菜FPS基因,并建立了其原核表达体系。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

杜仲EuCHIT1基因表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

构建了T7启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1的原核表达载体pET-EuCHIT1和pMCSG-EuCHIT1,其表达产物分别含6个组氨酸(6His)标签和6个组氨酸连接的麦芽糖结合蛋白(his6-tag–maltose-binding protein,MBP)标签,分别将重组载体遗传转化大肠杆菌细胞BL21(DE3),在37℃、150 rpm条件下培养至菌液OD值为0.4~0.8后,转到16℃、150 rpm条件下以1 m MIPTG诱导培养12 h,表达产物经SDS-PAGE分析,p ET-EuCHIT1/BL21(DE3)表达以包涵体形式存在36.03 kD融合蛋白,pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)成功表达可溶形式存在的77.21 kD融合蛋白。故可以使用pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)获得可溶的融合蛋白,为之后的EuCHIT1的多克隆抗体的制备和及功能研究奠定基础。     

热带念珠菌β-葡聚糖合成酶KRE9基因原核表达及其比活力测定

[目的]原核表达热带念珠菌(Candida tropicalis MYA-3404)β-葡聚糖合成酶(KRE9),并进行酶比活力测定,为研究其结构和生物学功能提供参考.[方法]提取热带念珠菌DNA,PCR扩增KRE9基因,构建其原核表达载体pET28a-KRE9后转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达及组氨酸(His)标签纯化树脂亲和柱纯化获得融合蛋白KRE9,并利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法测定其比活力.[结果]克隆获得的KRE9基因全长816 bp,编码271个氨基酸,与参考基因序列(GenBank登录号XM_002547984)的相似性高达99.75%.将其原核表达载体pET28a-KRE9转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过诱导表达及纯化获得重组蛋白KRE9,经SDS-PAGE检测,发现其纯度较高,大小约35 kD.Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白KRE9能与抗His抗体发生特异性结合.重组蛋白KRE9比活力为9.169×104U/mg.[结论]重组蛋白KRE9具有良好的特异性和较高β-葡聚糖合成酶活性,可用于其结构和生物学功能研究.     

H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列,合成HA基因;定向克隆到原核表达载体p ET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-HA;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示,重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;重组的HA融合蛋白约为84 ku,大小与预期融合蛋白大小一致;重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合,与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组HA融合蛋白表达。     

麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质

【目的】克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。【方法】采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质。【结果】克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 k D,理论等电点(p I)为8.9。构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DGPx4。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu2+和Ni2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg2+和Mn2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca2+和Zn2+对DGPx4活力则无明显的促进或抑制作用。【结论】从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用。     

利用NusA促溶标签原核表达Butelase 1蛋白

为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况。酶切和测序结果证实p ET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表达载体构建成功。SDS-PAGE分析结果表明诱导后表达的融合蛋白大小为94.9 k D,主要为可溶性表达,部分为包涵体表达。Western blot检测结果显示,纯化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗体鉴定时为特异性表达。     

利用NusA促溶标签原核表达Butelase 1蛋白

为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况。酶切和测序结果证实p ET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表达载体构建成功。SDS-PAGE分析结果表明诱导后表达的融合蛋白大小为94.9 k D,主要为可溶性表达,部分为包涵体表达。Western blot检测结果显示,纯化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗体鉴定时为特异性表达。     

广西青蒿资源研究现状

青蒿是我国传统中药,常用于消暑、明目、止汗等,其提取物青蒿素还可有效地治疗脑型疟疾。青蒿是一年生菊花科草本喜光植物,主要分布在海拔400m以下地区。广西青蒿资源丰富,全区40余个县市均有分布,为中国青蒿生产地的主要省份;2005年广西种植青蒿约670公顷,靖西县就达340公顷,且该地的青蒿提取物青蒿素含量可达1.2%。近年来,通过对青蒿野生资源的收集、筛选、生物学特性、组织培养、繁殖及栽培技术的深入研究,为建立稳定高产的青蒿生产提供了科学依据,促进了广西青蒿产业的发展。今后在青蒿生产过程中,实行中药材生产质量管理规范,保护其生物资源多样性,并利用现代生物技术,可确保青蒿生产达到高产、优质、安全和标准化,获得更多优质的青蒿,从而满足市场对青蒿素的需求。     

新疆一枝蒿与黄花蒿粗提物抗棉铃虫与棉蚜的特性研究

[目的]为利用新疆一枝蒿研制新型无公害植物杀虫药剂奠定基础.[方法]采用97;乙醇对新疆一枝蒿(Artemisia rupestris)和黄花蒿(Artemisia annua)进行了总提,将所得粗提物对棉花重要害虫-棉铃虫(Helicoverpa armigera)与棉蚜(Aphis gossypii)进行了生物活性测定,同时还使用新疆一枝蒿粗提物对棉铃虫开展了室内、室外的驱避实验.[结果](1)新疆一枝蒿与黄花蒿粗提物对棉铃虫半致死浓度LC50分别为3.515 7与4.781 1 mL/100g;(2)新疆一枝蒿与黄花蒿粗提物对棉蚜半致死浓度LC50分别为0.956与2.047 4g/100mL;(3)新疆一枝蒿粗提物对棉铃虫室内室外趋避率分别为28.39;与80.68;.[结论]新疆一枝蒿粗提物对棉铃虫与棉蚜的毒杀作用较好并高于黄花蒿粗提物,且新疆一枝蒿粗提物对棉铃虫有驱避和生长抑制等作用.     

296位氨基酸位阻效应影响黄花蒿没药醇合酶环化反应的起始

【目的】探究黄花蒿没药醇合酶第296位氨基酸突变抑制环化反应的机制。【方法】利用Quik Change?Multi Site-Directed Mutagenesis的方法将黄花蒿没药醇合酶的296位氨基酸残基由苏氨酸突变成异亮氨酸。原核表达,蛋白纯化后测定其催化特异性。【结果】黄花蒿没药醇合酶T296I体外催化(2E,6E)-法尼基焦磷酸主产物为非环化的法尼烯;但是将T296I蛋白与中间体(3R,6E)-橙花叔醇焦磷酸一起孵育时可生成环化的主产物α-bisabolol,野生型酶的天然产物。【结论】黄花蒿没药醇合酶T296I点突变进一步证明氨基酸残基的空间体积和立体化学是自然环化反应起始的控制关键,其位阻效应能够抑制法尼基焦磷酸向橙花叔醇焦磷酸转化。     

不同播种期对黄花蒿生长发育特性的影响

为了探索黄花蒿双季栽培的可行性,对不同播种期黄花蒿的生长发育特性进行了研究.结果表明:黄花蒿春、夏、秋三季均可播种,春、秋季播种的在8月下旬花芽分化,夏季播种的在9月中旬花芽分化.春季播种黄花蒿在6月上旬进入营养生长旺盛期.夏季播种黄花蒿在8月上旬进入营养生长旺盛期,由于营养生长期短,植株矮小,叶产量低.秋季播种黄花蒿在第2年5月上旬进入营养生长旺盛期,比当年春季播种的早1个月.     

蒿属植物的农药活性及其有效成分

综述了蒿属植物的杀虫、杀螨、杀菌、除草、杀线虫和杀软体动物活性及相应的有效成分。该属中具有杀虫杀螨活性的主要有黄花蒿、野艾蒿、苦艾、蒌蒿、毛莲蒿、西南牡蒿、大籽蒿、猪毛蒿、茵陈蒿、蒙古蒿、巴儿古津蒿、南亚蒿、犹地蒿和Artemisia monosperma等,其主要有效成分是桉树脑、龙脑、樟脑、石竹烯、异石竹烯和β-法呢烯等。该属中具有杀菌活性的主要有黄花蒿、银叶艾蒿、湿地蒿、苦艾、阿拉伯艾蒿、牛蒿、犹地蒿、巴儿古津蒿、蒌蒿、宽叶山蒿和Artemisia molinieri,其主要有效成分是樟脑、桉树脑、龙脑、类黄酮、烯烃、萜烃、烷烃和有机酸等。该属中具有除草活性的主要有魁蒿、油蒿、灰孢蒿、黄花蒿、三齿蒿、猪毛蒿和牛蒿,其主要有效成分是桉树脑、樟脑、蒿乙醚、单萜和倍半萜类化合物。苦艾具有杀线虫活性。具有杀软体动物活性的主要有苦艾和狭叶青蒿。其中的黄花蒿、苦艾、猪毛蒿、巴儿古津蒿和犹地蒿等活性多样,在植物性农药领域值得进一步研究和开发。     

不同施磷量对黄花蒿丛枝菌根形成、生长及产青蒿素的影响

【目的】确定适宜丛枝菌根真菌与黄花蒿共生的土壤磷素水平,为黄花蒿优质高效生产提供理论依据。【方法】采用盆栽试验,检测已接种摩西球囊霉（Glomusmosseae）的黄花蒿在4种磷肥水平（0、40、80和120mg／kg）下不同生育时期（早、中前期、中、中后和后期）的菌根侵染率、株高、茎基径等生长指标,以及叶绿素含量,收获后检测地上部干物重,枝和叶的氮、磷、钾含量,植株青蒿素含量。【结果】在各检测时期,施磷量80mg／kg的处理菌根侵染率均最高,分别为59．7％、66．3％、76．7％、86．3％和89．0％;菌根化黄花蒿植株地上部干物重、株高、茎基粗和叶绿素含量在不同施磷处理间差异不显著（P〉0．05）;施磷可以促进菌根化黄花蒿植株对氮素的吸收,但施磷量超过120mg／kg时促进氮素吸收的作用会下降。40mg／kg以下的低磷处理有利于菌根化黄花蒿植株对磷的吸收。高磷和低磷条件下,菌根化黄花蒿对钾的吸收差异不显著（P〉0．05）,叶片钾含量为3．45％～3．95％。施磷量达到120mg／kg时会显著降低菌根化黄花蒿的青蒿素含量（P〈0．05）。【结论】40～80mg／kg的施磷量最适宜丛枝菌根真菌与黄花蒿共生,植株有较高的青蒿素含量和生物产量。     

蒿属4种植物精油对绿豆象的杀虫活性测定

试验测定猪毛蒿、黄花蒿、水蒿、大籽蒿4种植物精油对绿豆象成虫的杀虫活性。结果表明:4种植物精油均对绿豆象有较好的熏杀及触杀活性。其中水蒿精油熏杀LC50为0.050 8 mL/L、触杀LC50为1.562 4 mg/L,均高于其他3种植物精油。     

青蒿素的化感效应及机理研究进展

青蒿素是我国自主研制的治疗疟疾的首选药,黄花蒿是提取青蒿素的唯一原料药材,在我国有2 000多年的药用历史。我国黄花蒿种质资源丰富,种植面积和青蒿素产量占全世界的90%以上。黄花蒿释放的化感物质——青蒿素影响植物、藻类和浮游动物的生长发育,对农业生产、土壤健康和水体生态系统造成重大影响。对青蒿素化感效应及机理的研究现状进行了综述,以期对评估黄花蒿种植产生的环境风险,保持土壤健康,避免影响后茬作物生长提供一定的参考。     

不同类型土壤对青蒿生长和生理特性的影响

在温室里对青蒿进行盆栽,研究4种不同类型土壤对青蒿生长、生理特性的影响。试验结果显示:种植于黄色沙壤土和黑色壤土的青蒿出苗时间、株高、茎粗、分枝数、冠幅、生物产量优于红色壤土和白色粘土,但前两者之间以及后两者之间差异并不显著。从生理状况来看,种植于黑色沙壤土的青蒿叶片叶绿素、丙二醛含量、过氧化物酶活性虽然相对较低,但可延长植株的衰老时间,保持较长的生长期。从青蒿素来看,以种植于白色粘土的青蒿叶片、花蕾与种子的青蒿素含量最高,黄色沙壤土次之,黑色壤土最低;各时期叶片以7月底和9月中旬的青蒿素含量最高。因此,以收获青蒿素为目的时,考虑到总生物量和植株单位质量青蒿素含量,认为将青蒿种植于黄色沙壤土最好。