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相似文献
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1.
倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。  相似文献   

2.
【目的】探究(S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响。【方法】在截短处设计引物,引物引入限制性内切酶酶切位点,PCR产物经双酶切,连接到相应载体,经大肠杆菌Rosetta菌株表达,亲和层析纯化蛋白后蛋白酶切去融合标签,高分辨质谱测定蛋白分子量。体外催化产物经GC-FID/MS分析产物变化,Malachite Green无机磷酸含量法测定表观Kcat。【结果】截短10、20、30、40个氨基酸融合蛋白表达及纯化成功,GCFID分析结果表明去标签的不同长度截短的酶催化主产物均为没药烯,显示活性没有丧失;随着N端截短氨基酸数目的增多,表观Kcat稍有变化。截短60个氨基酸的融合蛋白His-N60表达成功,但亲和层析失败,取表达的上清蛋白体外催化,结果显示无倍半萜合酶活性。【结论】N端截短40个氨基酸不影响其产物特异性和活性。此结果和其他报道不一致,显示不同的倍半萜合酶N端的作用可能不同。  相似文献   

3.
试验将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶(法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶)的基因进行融合,经大肠杆菌表达后鉴定其融合蛋白的功能。结果表明:融合蛋白具有了双功能酶活性。双功能酶基因的构建,为进一步将双功能酶基因转入黄花蒿,提高青蒿素含量奠定了基础。  相似文献   

4.
【目的】对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子LEF-10的第21位保守氨基酸残基进行饱和点突变,研究该位点突变对AcMNPV活性的影响,为进一步研究LEF-10朊病毒特性及其在病毒复制中的作用奠定基础。【方法】同源序列比对发现,LEF-10第21位亮氨酸残基高度保守。对pTriEx质粒载体上LEF-10第21位的亮氨酸残基通过异位回补进行饱和突变,将构建好的重组质粒与线性化的BacmidΔlef-10共转染草地贪夜蛾Sf9细胞构建重组病毒,研究LEF-10第21位上不同氨基酸残基对病毒活性的影响。同时联用Red/ET基因敲除系统和rpsl反向筛选系统对AcMNPV Bacmid的LEF-10基因进行原位突变,突变后的线性化Bacmid与pTriEx-p(p10)-dsRed质粒共转染草地贪夜蛾Sf9细胞构建原位突变型病毒,研究点突变对重组病毒活性的影响,并通过流式细胞术检测突变型病毒对晚期基因表达的影响。【结果】异位回补点突变重组病毒和原位点突变重组病毒转染和感染Sf9细胞的结果均表明,当LEF-10第21位亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、脯氨酸残基、半胱氨酸残基和甲硫氨酸残基时,可以拯救LEF-10缺陷型病毒,并产生具有感染性的重组病毒,但其他突变型重组病毒均为致死突变。将7种原位突变重组病毒分别以高MOI(MOI=10)和低MOI(MOI=1)感染Sf9细胞,结果表明低MOI感染Sf9细胞时,7种重组病毒外源蛋白的表达水平相当;高MOI感染Sf9细胞时,7种重组病毒外源蛋白的表达水平差异明显,其中突变为丙氨酸残基的重组病毒将外源蛋白的表达维持在较高水平。【结论】LEF-10第21位氨基酸残基对其功能起着至关重要的作用,该位点氨基酸残基的性质影响AcMNPV的活性。  相似文献   

5.
EMS处理甘蓝型油菜(Brassica napus)获得高油酸材料   总被引:7,自引:1,他引:6  
 【目的】对EMS诱变甘蓝型油菜后代主要脂肪酸含量进行检测,并对M2代中获得的高油酸材料在分子水平进行分析。【方法】利用0.5%、1.0%和1.5%共3个EMS浓度处理甘蓝型油菜(湘油15号),分析检测M1和M2代的主要脂肪酸含量;分别克隆高油酸突变体05-4和对照材料FAD2基因,对其进行核苷酸和氨基酸序列分析。【结果】浓度为1.5%时处理M2代发现了一株高油酸植株(油酸含量71%);序列分析表明,高油酸材料FAD2A基因第614位碱基A突变成G导致天冬氨酸变成甘氨酸,FAD2B基因第59位碱基A突变成C导致天冬酰胺变成苏氨酸,在第722位碱基A突变成T导致酪氨酸变成苯丙氨酸。【结论】采用浓度1.5%的EMS处理甘蓝型油菜对油酸含量有一定的影响。高油酸材料FAD2A中第205位残基天冬氨酸变成甘氨酸和FAD2B中第241位残基酪氨酸变成苯丙氨酸都发生在油酸减饱和酶催化中心,从而影响了蛋白质的空间结构,导致油酸含量提高。  相似文献   

6.
【目的】分析铁皮石斛Dendrobium officinale黄酮类化合物的生物合成途径及相关基因,为铁皮石斛黄酮类化合物代谢调控、药用价值的开发研究提供参考。【方法】利用Illumina HiSeq 4000测序平台对铁皮石斛2个生长阶段茎、叶进行高通量转录组测序,对组装获得的unigenes进行功能注释和黄酮类化合物的生物合成相关基因解析。【结果】铁皮石斛黄酮类化合物代谢相关Unigenes 48个,涉及14个酶。5个CHS相关Unigenes具有CHSlike保守结构域,活性位点氨基酸残基(Cys-His-Asn)高度保守,丙二酰辅酶A结合位点和产物结合位点的部分氨基酸残基发生变异。CHI(Unigene0013781)属于类型I查尔酮异构酶,异构化6′-羟基查尔酮为5-羟基黄烷酮。表达分析表明,2个生长时期的茎和叶,CHS(Unigene0008250)、 CHI(Unigene0013781)和F3H的表达量都高于CHS(Unigene0012884)和C3′H。【结论】通过对转录组数据分析,共获得铁皮石斛黄酮类化合物代谢相关Unigenes48个,涉及14个酶;5个CHS相关Unigenes中,2个编码查尔酮合酶,3个编码联苄合酶;CHI(Unigene0013781)属于类型I查尔酮异构酶。  相似文献   

7.
【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰Co A的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大肠埃希菌重组表达,突变重组酶特性经体外酶促反应测定。【结果】3种突变重组酶的相对分子质量为67 000;最适反应温度均为32.5℃,与野生酶DBAT一致;DBAT~(F160C)与DBAT的最适反应pH为7.5,略高于DBAT~(C165W)和DBAT~(N300I)的最适反应pH(7.0);DBAT~(C165W)、DBAT~(F160C)和DBAT~(N300I)的比活力与DBAT相比分别提高了61.5%、59.6%和19.2%,催化效率分别提高了55.4%、35.1%和2.9%,3种突变酶的米式常数(K_m)和最大反应速率(v_(max))均高于DBAT。【结论】疏水突变导致突变酶的比活力相比野生型均有显著提高,研究结果为体外高效酶促合成紫杉醇化学半合成的直接前体物巴卡亭Ⅲ奠定了基础。  相似文献   

8.
Pen a1抗原表位187-202关键氨基酸的筛选和鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】Pen a1是虾中主要的过敏原蛋白,其抗原表位与致敏作用有关。对Pen a1的一个抗原表位187—202中氨基酸的出现频率及保守性进行分析后合成突变肽,并检测该突变肽与表位抗体的结合能力,筛选关键氨基酸,为研究虾致敏机理及脱敏方法提供理论依据。【方法】利用MEGA5软件对Pen a1蛋白5个表位及其氨基酸的组成与出现频率进行分析,选出这些表位中出现频率大的氨基酸;对过敏原数据库中所有致敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列的保守性进行分析,筛选出保守性高的氨基酸。两种方法筛选出的共有氨基酸为潜在的关键氨基酸。用丙氨酸分别替代这些潜在的氨基酸形成突变肽。利用固相合成法分别合成原表位肽及突变肽。并将原表位肽作为免疫原免疫新西兰大白兔,获得表位多克隆抗体。利用间接ELISA方法及竞争性Dot-blot方法检测突变的表位肽与表位抗体IgE结合能力,筛选出结合能力明显下降的突变肽,其中替换的氨基酸即为该表位的关键氨基酸。【结果】谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)在表位中出现频率较大,并高于在Pen a1整体蛋白中出现的概率,为活性氨基酸。将序列在187—202的表位中氨基酸组成及出现频率进行统计,推测E、V、L可能为该表位的关键氨基酸。将SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白序列与Pen a1氨基酸序列用DNAMAN软件进行多序列比对,K、L、E、V、G在所有比对的序列中都存在,表明这5个氨基酸为保守氨基酸。选择共有的E、V、L为可能的关键氨基酸,用丙氨酸替代表位中E、V、L分别合成1、2和3号突变肽。用竞争性Dot-blot检测突变肽结合抗体能力,以提取纯化的虾致敏蛋白为包被原,用突变肽抑制虾蛋白结合抗体,发现原表位肽抑制作用明显,1号突变肽的抑制作用与原表位肽相似,2、3号肽的抑制作用明显低于原表位肽。谷氨酸突变的1号突变肽对表位活性并没有较大影响,说明谷氨酸不是该表位的关键氨基酸;而2、3号突变肽与抗体的结合能力明显降低,即亮氨酸和缬氨酸是该表位的关键氨基酸。同时,利用间接ELISA方法,将原表位肽和突变肽与兔血清反应,比较OD450值。结果显示,1号突变肽致敏性降低,OD450值约为对照的1/2.1,2号突变肽OD450值降低为对照的1/2.6,3号突变肽OD450值降低为对照的1/3.2。说明突变表位与表位抗体结合能力均有不同程度的降低。结合竞争Dot-blot试验结果,亮氨酸和缬氨酸为该抗原表位的关键氨基酸。【结论】建立了一种关键氨基酸的筛选和鉴定的方法。亮氨酸和缬氨酸被丙氨酸取代后,其与表位对应抗体的结合能力发生明显下降,是Pen a1中表位187—202的关键氨基酸。这种筛选关键氨基酸的方法可以用于其它抗原表位的关键氨基酸的确定及氨基酸对表位致敏性的影响,深入研究过敏原脱敏机理;同时也可用于基因工程或氨基酸修饰中降低过敏原致敏性。  相似文献   

9.
【目的】监测广东地区 H9N2 亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的遗传变异和分子进化趋势,为我国 H9N2 亚型 AIV 的防控提供参考。【方法】对 2022 年广东地区 3 株 H9N2 亚型 AIV 的 HA 和 NA 基因进行扩增、克隆、测序,使用 DNAStar、PhyloSuite 软件进行序列拼接和比对,再运用 MEGA、Megalign、 NetNGlyc 1.0 Server 等软件,对其核苷酸和氨基酸序列进行遗传进化、核苷酸同源性分析,以及受体结合、蛋白活性、耐药性和糖基化等关键位点分析。【结果】系统发育树和核苷酸同源性分析结果显示,3 株分离株的 HA 和 NA 基因分别属于 h9.4.2.5 分支和 1 分支,与早期毒株的核苷酸同源性分别为 81.6%~91.7% 和 88.2%~91.2%,分别命名为 h9.4.2.5c 分支和 1.2 分支;核苷酸和氨基酸序列分析发现,HA 裂解位点为 PSRSSR ↓ GLF,受体结合位点产生 I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变,糖基化位点产生 218N 非糖基化和新增 313N 糖基化突变;NA 茎部缺失 187~195 位 9 个核苷酸(ACAGAGATA),导致缺失 63~65 位 3 个氨基酸(TEI);NA 红细胞结合位点产生 K/E/S368N、D369N 突变,与 NA 蛋白活性,耐药性的相关位点 E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 均未发生突变。【结论】 2022 年广东地区分离的 3 株 H9N2 亚型 AIV 已经进化成新的亚群,部分突变可能增强了对哺乳动物的适应性,且其抗原性发生改变,但尚未获得对奥司他韦和扎那米韦等抗流感病毒药物的耐药性。  相似文献   

10.
牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS Geranyl diphosphate synthase)为短链异戊烯基合酶家族成员,催化1分子的IPP与DMAPP形成GPP,为单萜提供碳骨架。实验从我国薄荷品种"738"中克隆了GPPS大小亚基cDNA全长序列,对其进行序列分析,并研究GPPS基因在薄荷根、茎、叶、花中的相对表达量。结果:GPPS大亚基cDNA序列ORF全长1131 bp,编码377个氨基酸,GPPS小亚基cDNA序列ORF全长942 bp,编码313个氨基酸。研究获得的GPPS基因所编码氨基酸与薄荷属其他种的GPPS氨基酸序列高度相似。GPPS大亚基基因在薄荷品种"738"不同组织中均有表达,幼叶中的表达量最高。  相似文献   

11.
[目的]为防治鸡球虫病提供合理的用药方案。[方法]以1日龄健康AA肉仔鸡为试验动物,复方中药(青蒿、常山、仙鹤草、地榆炭、当归等按一定比例合成。)和盐霉素(西药)为供试药品,对肉仔鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫,然后将供试药物按一定剂量拌入鸡饲料,研究复方中药和西药单独及联合用药对鸡球虫病的防治效果。[结果]盐霉素组、0.50%、0.25%、0.10%和0.05%复方中药组的抗球虫指敷和鸡存活率分别为124.51、113.55、138.74、146.70、117.03和80.00%、70.00%、83.33%、86.67%、66.67%,2组中西药结合组的抗球虫指数分别为136.44和131.11。[结论]0.1%复方中药的抗球虫效果最好,且优于常用抗球虫药物盐霉素,而中、西药联合用药并无明显的抗球虫效果。  相似文献   

12.
李庚飞 《安徽农业科学》2012,(19):10258-10260
[目的]研究不同蒿类植物对重金属Cd的积累特性。[方法]以潼关县黄金生产区及附近不同地区生长的6种蒿类植物(叉枝蒿、青蒿、水蒿、茵陈蒿、莳萝蒿、艾蒿)为研究对象,测定并分析蒿类植物体内的Cd含量,以便确定建立人工生态系统的植物种类。[结果]水蒿-13茎中Cd含量为6种植物中最高,其值为42.55 mg/kg,叉枝蒿-11叶片中Cd含量次之,其值为30.59 mg/kg;2个样区中的叉枝蒿对Cd的转移能力为6种植物中最高,叉枝蒿-11的转移系数为2.1,叉枝蒿-3的转移系数为1.96;随着土壤中重金属含量的增加,植物体内对重金属的富集有增加趋势。[结论]该矿区可选用水蒿和叉枝蒿进行重金属Cd的生态修复。  相似文献   

13.
[目的]研究黄花蒿生殖期光合特性。[方法]采用Li-6400便携式光合作用系统测定生殖期黄花蒿叶片的有关光合参数。[结果]黄花蒿生殖期的光合日变化曲线呈双峰型,峰谷之间差别不大。生殖期黄花蒿叶片仍有较强的光合作用,一天中最大净光合速率为22.60μmol/(m2.s)。生殖期黄花蒿叶片的光饱和点为800μmol/(m2.s)左右,光补偿点为21.98μmol/(m2.s),表观光量子效率为0.046;其CO2饱和点应不低于1600μmol/mol,CO2补偿点为70.37μmol/mol,羧化效率为0.053。[结论]生殖期黄花蒿叶片存在较缓和的"午休"现象,此期较强光合作用的绿叶仍能为黄花蒿花的发育及种子生长提供一定的物质和能量。生殖期黄花蒿叶片适应一定的荫蔽环境。  相似文献   

14.
黄花蒿叶矿质元素含量的研究   总被引:1,自引:1,他引:0  
[目的]了解广西野生黄花蒿的矿质元素含量,为建立黄花蒿质量标准提供参考。[方法]在广西都安县、田林县、龙胜县、岑溪市和北海市各选1个种群采集黄花蒿叶片,测定黄花蒿叶中的大量元素、微量元素及重金属的含量。[结果]黄花蒿叶中含有丰富的P、K、Ca、Mg等大量元素和Fe、Mn、Zn等微量元素,而对人体有害的重金属元素的含量少。N、K、Ca、P、Mg的平均含量分别为32.6、31.1、8.94、4.143、.02 g/kg,Fe、Mn、Sr、Zn、Ni、Se的平均含量分别为4061、22.5、57.7、52.83、.600、.069 mg/kg。黄花蒿叶中重金属元素的含量由大到小依次为:Cu>Cr>Pb>As>Co>Cd>Hg。[结论]广西产中药材黄花蒿叶具有较高的矿质营养价值。  相似文献   

15.
[目的]调查广西野生黄花蒿根际土壤丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizae,AM)真菌与野生黄花蒿的共生情况及其根际土壤理化性状差异,为筛选对广西野生黄花蒿生长有明显促进作用的高效菌株及推动AM真菌在黄花蒿生产上的应用提供理论依据.[方法]采集野生黄花蒿根际2~30 cm土样,分别测定土壤pH、有机质碳、速效磷、碱解氮和速效钾含量,采用湿筛倾析—蔗糖离心法分离AM真菌孢子,观察记录孢子数量、形态并进行AM真菌类型划分和鉴定.[结果]不同采样点的野生黄花蒿均被AM真菌侵染,对野生黄花蒿的侵染率在29.15%~40.43%,其中崇左市土样的侵染率最高,南宁马山县土样的侵染率最低;10 g风干土样中的孢子数量以崇左市的最高(163个),百色田林县的最低(32个);不同样点的侵染强度为2~3级,属中等偏下水平.不同样点的土壤pH在7.61~8.38,属弱碱性土壤;土壤有机质碳含量为5.15~58.08 g/kg,速效磷、碱解氮和速效钾含量分别为54.71~551.20、98.70~595.00和66.89~547.30 mg/kg,不同样点间差异明显.AM真菌孢子密度、种类丰度(SR)和物种多样性指数也因采样点不同而存在明显差异.从9个地区55份土样中共分离出42种不同种类的AM真菌.[结论]广西野生黄花蒿根际AM真菌的分布因地理位置不同而存在差异,与土壤营养状况基本呈反比.野生黄花蒿根际土壤环境差异可能是造成AM真菌多样性的重要原因.  相似文献   

16.
法呢基焦磷酸合酶(FPS)是治疗疟疾的特效药物——青蒿素生物合成途径的关键酶。运用RT-PCR方法从青蒿高产株系001中克隆法呢基焦磷酸合酶基因;构建His标签融合蛋白FPS表达载体,进行原核诱导表达、蛋白纯化及酶活性测定的研究。结果表明:克隆的FPS基因和文献已报道的2个青蒿FPS基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98.83%和99.42%;原核诱导表达的His标签融合蛋白FPS的表达量高、可溶性好,具有FPS酶活性。  相似文献   

17.
青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析(英文)   总被引:1,自引:0,他引:1  
[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行其序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并通过DNAman、NCBI Blast、ExPASy ProtParam等工具,对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。由SS基因翻译出来的蛋白质分子量为47.8394KDa,理论等电点为8.57,无信号肽。疏水性分析表明,在400~417区域疏水性较强。跨膜区分析表明有3处跨膜区域,分别为170~186位的17个氨基酸、282~305位的24个氨基酸、387~407位的21个氨基酸。通过NCBI的BLAST程序分析指出,该基因编码的氨基酸序列含有Trans_IPPS_HH的保守区域,也具有与Mg2+结合有关的活性中心——富含天门冬氨酸的区域(DXXDD)。2级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。  相似文献   

18.
[目的]明确2种菊科植物的抑菌活性。[方法]以干苦菜、黄花蒿作为供试材料,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌作为供试细菌,采用滤纸片法通过抑菌圈的大小研究干苦菜、黄花蒿及其复配提取液的抑菌活性。[结果]在供试浓度为0.1 g/m L时,2种植物的提取液及2种植物的复配混合液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用,并且每1种植物提取液对至少1种菌的抑菌率大于70%,其中黄花蒿提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌率大于80%,苦菜提取液对大肠杆菌的抑菌率大于85%,苦菜与黄花蒿提取液的复配混合液对大肠杆菌的抑菌率约为100%。[结论]苦菜、黄花蒿有较好的抑菌活性,可进一步研究开发。  相似文献   

19.
[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。  相似文献   

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