R—prime质粒pMN53在不同根瘤菌中的稳定性

ｐＭＮ５３是以ｐＭＮ２为载体克隆有菜豆根瘤菌共生基因的Ｒ－ｐｒｉｍｅ质粒，将ｐＭＮ５３接合转移到快生型大豆根瘤菌Ｂ５２，慢生型大豆根瘤菌２２１０以及紫云英根瘤菌７６５３Ｒ后，分别考察了ｐＭＮ５３在３种转移接合子中的稳定性。结果表明由ｐＭＮ５３携带的卡那霉素抗性（Ｋｍ＾ｒ）在３种供试菌株中都能稳定传代，但电泳分析都只能检测到载体质粒ｐＭＮ２，载体上所携带的外源基因脱落。用Ｔｎ５为探针进行的斑点杂交，     

外源共生质粒pJB5JI导入紫云英根瘤菌中的稳定性

将碗豆根瘤菌共生质粒ｐＪＢ５ＪＩ导入紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其消除了共生质粒的突变株７６５３Ｒ＋１。两种类型转移接合子在人工合成培养基上繁殖时，ｐＪＢ５ＪＩ能稳定存在，但从它们在碗豆或紫云英上所结根瘤的分离物中，只有部分检测到ｐＪＢ５ＪＩ。以转座子Ｔｎ５及苜蓿根瘤菌ｎｏｄ基因为探针，对未检测到ｐＪＢ５ＪＩ质粒的根瘤分离物７６５３ＲＡ９及７６５３Ｒ＋１Ｐａ，进行ＤＮＡ同源性分析，结果表明ｐＪＢ５ＪＩ     

外源共生质粒pJB5JI导入紫云英根瘤菌（Rhizobium huakuii）中的稳定性

将碗豆根瘤菌共生质粒ｐＪＢ５ＪＩ导入紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其消除了共生质粒的突变株７６５３Ｒ＋１。两种类型转移接合子在人工合成培养基上繁殖时，ｐＪＢ５ＪＩ能稳定存在，但从它们在碗豆或紫云英上所结根瘤的分离物中，只有部分检测到ｐＪＢ５ＪＩ。以转座子Ｔｎ５及首蓿根瘤菌ｎｏｄ基因为探针，对未检测到ｐＪＢ５ＪＩ质粒的根瘤分离物７６５３ＲＡ９及７６５３Ｒ＋１Ｐａ，进行ＤＮＡ同源性分析，结果表明ｐＪＢ５ＪＩ质粒并没有全部丢失，很可能全部或部分整合到了受体紫云英根瘤菌的染色体中。     

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakui)7653R质粒

在ｐＲＫ２０７３的辅助作用下,通过三亲本接合转移,将Ｔｎ５（ｓａｃＢ－ｌｕｘＡＢ）插入华癸根瘤菌７６５３Ｒ菌株基因组中。将３２００个Ｔｎ５标记菌株影印到含有８％蔗糖的ＹＭＡ平板,检测这些菌株的发光酶活性和新霉素抗性。共获得８个菌株,其选择标记消失。质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除。结瘤实验证明,所有共生质粒部分缺失（有的缺失达１／３）的菌株依然结瘤。经用ｌｕｘＡＢ探针的分子杂交证实,８个菌株中有３个对应的标记菌株其Ｔｎ５插在共生质粒上。     

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌（Mesorhizobium huak …

在ｐＲＫ２０７３的辅助作用下,通过三亲本接合转移,将Ｔｎ５（ｓａｃＢ－ｌｕｘＡＢ）插入华癸根瘤菌７６５３Ｒ菌株基因组中。将３２００个Ｔｎ５标记菌株影印到含有８％蔗糖的ＹＭＡ平板,检测这些菌株的发光酶知性和新霉素抗性。共获得８个菌株,其选择标记消失。质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除。结瘤实验证明,所有共生质粒部分缺失（有的缺失达１／３）的菌株依然结瘤。经用ｌｕｘＡＢ探针的分子杂交证实,     

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达

将拟南芥ＡＴＬＰ－３基因从质粒ｐＵＣＴＬ亚克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,得到了质粒命名为ｐＢＩＴＬ。被亚克隆到重组质粒ｐＢＩＴＬ的ＡＴＬＰ－３基因通过农杆菌ＬＢＡ４４０４介导法导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ Ｌ．ｖａｒ Ｇｅｘｉｎ Ｎｏ．１）。通过卡那霉素抗性筛选,得到１９株再生烟划植株。ＰＣＲ（用根据ＣａＭＶ３５ｓ启动子和ＮＯＳ终止子序列合成的引物）分析表明,ＡＴＬＰ－基因是在     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

苜蓿花叶病毒复制酶（P2亚基）基因全长cDNA植物表 …

利用含有苜蓿花叶病毒中国分离株（ＡＩＭＶ－Ｃｈ）复制酶（Ｐ２亚基）基因编码区５’端ｃＤＮＡ（１３０６ｂｐ）的重组质粒ｐＡＭ５和编区３’端及其非编码区（１２３４ｂｐ的重组质粒ｐＡＭ３构建了含有复制（Ｐ２亚基）基因全长ｃＤＮＡ及其３’端非编码区的重组质粒ｐＡＭ３５,并将其重组于植物表达载体ｐＧＡ６４３,构建其正链ＲＮＡ的表达载体ｐＧＡ３５,为进一步开展转基因研究创造条件。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），扩增克隆传染性法低囊病病毒超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）ＨＺ株ＶＰ２基因，并ＶＰ２基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析，同时将ＶＰ２基因与真核表达载体ｐｃＮＤＡ３相连接。结果克隆到ＶＰ２基因全序列长１３５６ｂｐ，分析表明ＨＺ株与欧洲超强毒株ＵＫ６６１高度相似，同时将ＶＰ２基因正向插入ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游，得到了ＶＰ２基因的真核表达质粒。为ＩＢＤＶ分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。     

马立克氏病病毒gB基因的重组痘苗质粒构建

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ｇＢ基因序列设计ＰＣＲ引物,以ｇＢ质粒为模板,扩增出ＭＤＶｇＢ基因５’端到３’端３８８ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶消化ＰＣＲ产物,将其克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒,构建中间质粒Ⅰ;用ＸｂａⅠ消化ｇＢ质粒,切出ＭＤＶｇＢ基因ＸｂａⅠ片段,并正向克隆入中间质粒Ⅰ的ＸｂａⅠ位点,将ＭＤＶｇＢ基因１３７ｂｐ的ＰＣＲ产物与其ＸｂａⅠ片段正向连接,构建中间质粒Ⅱ用ＥｃｏＲⅠ调出中间质粒Ⅱ中的ＭＤＶｇＢ基因,正向克隆入痘苗病毒表达载体ｐ１６启动子下游,构建ＭＤＶｇＢ基因表达质粒ｐ１６－ＭＤＶｇＢＭＤＶｇＢ基因重组痘苗表达质粒的成功构建,为下一步进行重组病毒的构建及ＣＴＬ应答的深入研究奠定了基础     

AcMNPV-1A在转P35基因细胞系中连续传代的研究

报道了1株粉纹夜蛾转P35基因工程细胞系,命名为Tn5B-35。苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Au-tographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,AcMNPV)在该细胞系中连续传代至25代,与原始细胞系Tn5B1-4相比较,其感染率、多角体产量、滴度以及杀虫毒力的变化趋势均比较平稳,并未出现"传代效应"。     

应用根瘤菌剂接种“天府三号”花生的效果

1984—1985年,在涪陵地区进行花生根瘤菌剂接种试验,以不同花生根瘤菌株C_1、01、97—1、009接种“天府三号”花生品种,均比不接种增产,C_1增产达到极显著,又用C_1菌株接种不同花生品种,以793—28,795—122增产效果显著;在该区紫色土壤上接种C_1根瘤菌剂5208.7亩,平均增产10.37％,增收花生23.03万斤,经济效益11.51万元。实践证明,选择根瘤菌株与花生品种组合发挥了根瘤菌剂的增产效果。     

棉铃虫中肠Cry1A受体蛋白氨肽酶N1在Tn细胞系的表达

 【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1（APN1）基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC 19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞（Tn-5B1-4）,获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。【结果】SDS-PAGE分析和点杂交显示,目的基因得到了成功表达。【结论】APN1基因在Tn细胞中成功表达,为今后继续研究其功能和与抗性的关系奠定了基础。     

Germline transmission of exogenous genes in the chicken

Difficulties associated with in vitro manipulation and culture of the early chicken embryo have restricted generation of transgenic chickens to approaches that use replication-competent retroviruses. The need to produce transgenic chickens in the absence of replicating virus prompted development of a new method of gene transfer into the chicken. Microinjection of the replication-defective reticuloendotheliosis virus (REV) vector ME111 beneath unincubated chicken embryo blastoderms results in infection of germline stem cells. This vector contains genetic information exogenous to the chicken genome, including both the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase gene and the Tn5 neomycin phosphotransferase gene. About 8 percent of male birds hatched from injected embryos contained vector DNA in their semen. All four positive males tested passed vector sequences onto their progeny. Analysis of G1 offspring showed that gonads of G0 male birds were mosaic with respect to insertion of vector provirus. Thus, primordial germ cells present in the unincubated chicken embryo blastoderm are susceptible to infection by defective REV vectors.     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DX01转座突变株的构建及转化体系的优化

Tn5转座子及其衍生载体被广泛应用于革兰氏阴性菌的基因功能研究,但尚未见有利用Tn5转座子导入革兰氏阳性菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DX01菌株的报道.本研究通过构建Tn5转座载体,对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的突变株.同时,考察了感受态细胞培养浓度、电击电压、电...     

Rapid identification of nonessential genes of herpes simplex virus type 1 by Tn5 mutagenesis

The large genome of herpes simplex virus type of (HSV-1) encodes at least 80 polypeptides, the majority of which have no recognized function. A subgroup of these gene products appears to be nonessential for virus replication in cell culture, but contributes to the complex life cycle of the virus in the host. To identify such functions, a simple insertional mutagenesis method has been used for selective inactivation of individual HSV-1 genes. The bacterial transposon Tn5 was allowed to insert randomly into cloned restriction fragments representing the entire short unique (US) region of the HSV-1 genome. Of the 12 open reading frames that were mutagenized with Tn5, mutant derivatives of US2, US4, and US5 were recombined into the virus. These three genes proved to be nonessential for HSV-1 replication in Vero (African Green monkey kidney) cells and the US4 gene appeared to be involved in viral pathogenesis in the central nervous system of mice. This rapid mutagenesis procedure should prove useful in exploring the entire HSV-1 genome as well as the genomes of other complex animal viruses.     

根瘤菌菌株和接种根瘤菌植株的耐旱性研究进展

干热地区适生豆科树种及其特有的固氮根瘤菌为该地区生态植被恢复和农业生产能力提高提供了新的方法和发展思路。在干热地区能筛选出耐干热的根瘤菌菌株和接种根瘤菌植株,接种耐干热的根瘤菌能提高寄主豆科植物的耐干热能力,但其机理国内外鲜有研究。