跨膜蛋白39A基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3.937×10⁸~3.937×10³拷贝·μL^-1范围内呈良好的线性关系,R²可达0.999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3.937×10² 拷贝·μL^-1;组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。     

禽腺病毒4型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

本研究建立了可用于检测血清4型禽腺病毒(FAV)的特异性实时荧光PCR方法。试验表明,本方法特异性强,与血清8型FAV无交叉反应。灵敏度试验结果表明,本方法的检测样品最小量可为100拷贝·μL^-1。通过临床应用证实,该方法可快速灵敏准确地检测血清4型FAV,极大地缩短检测时间。     

硒肥对基质培番茄生长和矿质元素积累的影响

为研究基质栽培条件下外源硒对番茄的生物效应,以硒酸钠为硒源,设10个硒浓度水平,分别为0(CK)、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00和80.00 μmol·L^-1,研究外源硒对番茄生物量、产量、品质,以及各器官硒积累、转运和其他矿质元素积累的影响。结果表明:0.25、1.00和5.00 μmol·L^-1硒酸钠处理的番茄地上干物质含量高于其他处理,1.00和5.00 μmol·L^-1硒酸钠处理的番茄地下干物质含量次于0.50 μmol·L^-1硒酸钠处理,且高于0.25 μmol·L^-1硒酸钠处理。40.00 μmol·L^-1硒酸钠处理的番茄维生素C (V_C)和可溶性糖含量最高,硝酸盐含量次于80.00 μmol·L^-1硒酸钠处理;0.25和5.00 μmol·L^-1硒酸钠处理的番茄V_C、可溶性糖和硝酸盐含量均次于40.00 μmol·L^-1硒酸钠处理,0.50 μmol·L^-1硒酸钠处理的番茄硝酸盐含量较CK增加21.52%;除20.00 μmol·L^-1硒酸钠处理外,其他处理糖酸比均高于CK。5.00 μmol·L^-1硒酸钠处理产量显著高于其他处理,硒酸钠>10.00 μmol·L^-1时,番茄产量均低于CK。施硒可促进番茄各器官硒的积累和转运,果实硒的积累量随着外源硒浓度增大成倍增加;番茄叶片硒转运能力最强,果实最弱。5.00 μmol·L^-1硒酸钠处理的番茄N和Ca元素含量最高,均显著高于其他处理,较CK分别增加10.75%和295.20%;1.00、2.50、5.00和10.00 μmol·L^-1硒酸钠处理的番茄P元素含量显著高于其他处理;施硒促进了番茄对Mg(10.00 μmol·L^-1硒酸钠处理除外)和Fe(20.00 μmol·L^-1硒酸钠处理除外)的吸收。适宜硒浓度能增加植株干物质含量,改善品质,提高产量和促进矿质元素吸收。在富硒番茄生产上,建议采用5.00 μmol·L^-1硒处理,起到增产提质的作用。     

不同杀菌剂对柑橘黑点病菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法测定氟啶胺、咪鲜胺和代森锰锌对柑橘黑点病的室内毒力。结果表明,3种药剂抑制菌丝生长的平均EC₅₀值分别为0.026,0.054和18.15 μg·mL^-1,杀菌剂对黑点病菌的室内毒力表现为氟啶胺>咪鲜胺>代森锰锌,可见氟啶胺在柑橘黑点病防治中具有较好的开发应用潜力。     

紫花苜蓿MsOXO基因的克隆及表达分析

草酸氧化酶(OXO)在包括核盘菌在内的多种病原体的防御和植物改良中有重大作用。以紫花苜蓿为材料,克隆得到紫花苜蓿草酸氧化酶基因MsOXO。利用烟草瞬时表达进行亚细胞定位,结果显示,MsOXO定位在细胞壁上。qRT-PCR结果显示,MsOXO在紫花苜蓿的根、茎、叶中均有表达,但在根茎中表达量较低,这可能是根颈和茎基部更易被病菌侵染的原因。外源草酸50 μmol·L^-1处理根或100 μmol·L^-1处理茎及外源水杨酸100 μmol·L^-1处理根均可以诱导MsOXO基因的上调表达。     

肉牛呼吸道感染主要细菌性病原多重PCR检测方法的建立

为了建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)这3种肉牛呼吸道病原菌的多重PCR检测方法,采用肺炎克雷伯菌Khe基因、约翰逊不动杆菌Ptk基因、多杀性巴氏杆菌Abhd基因设计特异性引物,经过特异性、敏感性、引物浓度、退火温度试验,建立多重PCR检测方法的反应条件和体系。结果显示,该方法能同时扩增出肺炎克雷伯菌、约翰逊不动杆菌和多杀性巴氏杆菌,3种目的菌扩增测序与GenBank上的细菌基因序列相似性均高于99%,对其他10种肉牛呼吸道病原菌扩增结果均为阴性。对3种病原基因组DNA的检测下限分别为69.8×10^-5、208.9×10^-4、70.8×10^-3 ng·μL^-1,最佳引物浓度比例为1:1:1,最佳的退火温度为58 ℃。该方法特异性强、敏感性高,为上述3种病原的快速检测、鉴定和临床牛呼吸道疾病的诊断提供了一种方便、快捷和准确的工具。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肝中3种β-受体激动剂残留

建立猪肝中3种β-受体激动剂克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。3种β-受体激动剂在0.1~10.0 μg·L^-1呈现良好线性关系,相关系数大于0.998,检出限为0.002 8~0.011 0 μg·kg^-1,定量限为0.009 3~0.038 0 μg·kg^-1,加标回收率在86.9%~116.8%,相对标准偏差在0.67%~3.41%,分析在7 min内完成。建立的方法操作简单,灵敏度高,重复性好,可用于肉类样品中β-受体激动剂残留的测定。     

毒死蜱和百菌清对斑马鱼早期发育阶段的联合毒性效应

为评价毒死蜱和百菌清的单剂毒性和联合毒性,以斑马鱼为受试生物,采用静态法和实时荧光定量PCR方法,研究毒死蜱和百菌清单剂,以及二元组合时对斑马鱼胚胎的急性毒性和对斑马鱼幼鱼性腺轴相关基因的影响。结果显示,毒死蜱和百菌清对斑马鱼胚胎分别表现为中等和高等毒性,96 h-LC₅₀(半致死浓度)分别为2.139 mg·L^-1和0.353 mg·L^-1。毒死蜱和百菌清联合作用类型为协同作用,联合暴露时,对斑马鱼胚胎的96 h-LC₅₀分别为0.38 mg·L^-1和 0.063 mg·L^-1。中浓度(26.7 μg·L^-1)和高浓度(106.7 μg·L^-1)的毒死蜱可以诱导斑马鱼幼鱼体内芳香化酶基因(CYP19α)、卵黄蛋白原基因(VTG1、VTG2)和雌激素受体基因(ERα、ERβ1、ERβ2)不同程度的上调表达;低浓度(1.1 μg·L^-1)百菌清诱导斑马鱼体内VTG1、VTG2、ERβ1和ERβ2基因的上调表达;低浓度(6.7 μg·L^-1毒死蜱+1.1 μg·L^-1百菌清)二元组合会引起斑马鱼体内VTG1、ERβ1、ERβ2和ERα基因下调。说明毒死蜱和百菌清对斑马鱼幼鱼具有雌激素内分泌干扰效应,但毒死蜱和百菌清二元组合对斑马鱼幼鱼的雌激素内分泌干扰效应降低。在评估农药对水生生物的危害时,应充分考虑复合污染时的联合效应。     

利用原子荧光仪多次测定砷、汞稳定性分析

对砷、汞标准溶液各进行20次连续进样,利用6项统计指标对砷、汞在原子荧光仪检测过程中表现出来的稳定性差异进行了分析。发现10μg·kg^-1砷连续进样20次得到的荧光值、浓度值平均值分别为441.26、9.802μg·kg^-1,中位值分别为440、9.775μg·kg^-1,极差分别为16.86、0.375μg·kg^-1,偏度系数都为0.732,峰度系数分别为-0.457、-0.456。1μg·kg^-1汞连续进样20次得到的荧光值和浓度值平均值分别为761.94和1.035μg·kg^-1,中位值分别为762、1.035μg·kg^-1,极差分别为81.59、0.111μg·kg^-1,偏度系数分别为-0.435和-0.414,峰度系数分别为-0.246和-0.271。统计发现,10μg·kg^-1砷数值的大小并没有明显的趋势性特点,1μg·kg^-1汞在第5针后有明显变动向上的趋势。     

生物农药对杨梅果腐病的防治效果

评价6种生物农药和1种化学农药对杨梅果腐病的防治效果。结果表明,相比于清水对照,施用8 000 IU·μL^-1苏云金杆菌悬浮剂和1 000亿芽孢·g^-1枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对杨梅果腐病的防治效果最为理想,防治效果在78.8%92.3%。考虑到农药减量,以上2种生物药剂搭配250 g·L^-1嘧菌酯也能达到良好的防治效果。     

膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

[背景]柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)侵染引起的一种柑橘病害.对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等.前3种方法都需要依靠准确的...     

携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力

[背景]在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展.前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙...     

维生素C对β-伴大豆球蛋白诱导的仔猪肠上皮细胞炎性损伤的保护作用

为分析不同浓度维生素C(vitamin C,V_C)对β-伴大豆球蛋白(7S)诱导的仔猪肠上皮细胞(IPEC-J2)炎性损伤的保护作用,取对数生长期的IPEC-J2用于试验,随机分为对照组、7S模型组(5 mg·mL^-1 7S)和V_C(25、50、100、200、400、600、800、1 000 μmol·L^-1)保护组。细胞培养24 h后采用CCK-8法检测细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态学变化,ELISA法检测细胞上清液中LDH、ALP、DAO、IFABP1含量和IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10的分泌水平,用qRT-PCR法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10 mRNA相对表达量。结果显示:7S可显著(P<0.01)降低IPEC-J2活力、破坏细胞膜完整性,上调细胞促炎性因子和下调抗炎因子的产生;与7S模型组相比,同时添加7S和V_C的试验组细胞活力增加,细胞上清液中LDH、ALP、DAO、IFABP1含量显著(P<0.01)降低,促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平降低,抗炎因子IL-4和IL-10的分泌水平升高。因此,不同浓度V_C均可保护由7S诱导引起的仔猪肠上皮细胞损伤,100 μmol·L^-1 V_C的修复和保护作用最佳。     

玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立

玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis)是进境玉米重要检疫性病原物之一。通过分析比较玉米内州萎蔫病菌的纤维素酶基因celB,筛选出独特和保守的基因序列用于设计引物和探针,利用重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)建立玉米内州萎蔫病菌的荧光RAA检测方法。以celB基因序列作为靶标序列设计出引物2F、6R和探针P,建立了玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法,该方法在39 ℃恒温条件下,20 min内可完成检测反应,特异性好,且灵敏度高达130 fg·μL^-1,利用该方法检测4份玉米模拟样本阳性,8份玉米真实样品阴性,检测结果与参照国家标准GB/T 36840—2018一致。结果表明,建立的荧光RAA检测方法快速、特异、灵敏,能够满足现场检测要求。     

基于PCR和巢式PCR技术的玉米南方锈病早期检测

【目的】建立巢式PCR方法,快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌(Puccinia polysora),为玉米南方锈病(southern corn rust)的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列,在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R,建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系：Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL^-1)0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)2μL,d NTP Mixture(各2.5 mmol·L^-1)1.6μL,上下游引物(10μmol·L^-1)各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH₂O。扩增程序：利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,...     

维生素A对大豆7S球蛋白致仔猪肠上皮细胞屏障功能损伤的影响

以仔猪肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究对象,用大豆7S球蛋白作为诱导因素,通过检测细胞活力、细胞跨膜电阻(TEER)、荧光素钠渗透率、细胞膜完整性相关指标与紧密连接蛋白的mRNA表达情况,探究维生素A(V_A)对大豆7S球蛋白致IPEC-J2细胞屏障功能损伤的影响。结果显示:5.0 mg·mL^-1大豆7S球蛋白导致IPEC-J2活力、TEER与ZO-1、Claudin-1、Occludin的mRNA表达量极显著(P<0.01)降低,而荧光素钠渗透率和细胞培养液中碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、二胺氧化酶(DAO)、肠型脂肪酸结合蛋白1(IFABP1)的含量极显著(P<0.01)升高;添加0.1和1 μmol·L^-1 V_A极显著提高了细胞活力(P<0.01),0.1~10 μmol·L^-1 V_A显著(P<0.05)缓解了大豆7S球蛋白导致的TEER、荧光素钠渗透率、细胞膜完整性相关指标与紧密连接蛋白mRNA表达的变化;10 000 μmol·L^-1 V_A反而加剧了这些影响。总体上,0.1~10 μmol·L^-1 V_A能通过保护细胞活力和细胞完整性、影响紧密连接蛋白的mRNA表达对大豆7S球蛋白导致的IPEC-J2细胞屏障功能损伤发挥保护作用,而10 000 μmol·L^-1 V_A反而加重了这种损伤。