牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一，具有细胞因子样功能，在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体，将M17基因插入pET-32a原核表达载体，构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，通过IPTG诱导M17蛋白表达，利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示，IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主；Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL^-1；多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16，经Western blotting分析可见单一目的条带，说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知，M17重组蛋白表达成功，且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。     

重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.     

小反刍兽疫病毒非结构蛋白C的原核表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒(PPRV)中扩增出C基因。将C基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建出重组表达质粒pGEX-6P-1-PPRV-C。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞后,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达出的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定正确后,免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果表明:C蛋白在大肠埃希菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为42ku;Western-blot结果表明重组C蛋白具有良好的反应原性;琼脂扩散试验结果表明制备的抗C蛋白多抗血清效价为1∶2。这一研究成功克隆出C基因,制备出多克隆抗体血清,为今后进一步深入研究C蛋白的功能提供了生物材料。     

塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64 000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。     

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

利用hAPOA1原核蛋白生产兔多克隆抗体

将hAPOA1的阅读框连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成正确的pGEX-4T-1-hAPOA1原核表达质粒,然后将其转入宿主菌BL21,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的55.4ku的融合蛋白;将纯化后的包涵体融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗hAPOA1血清并检测抗体效价。结果表明,经间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)及蛋白质免疫印迹(WesternBlot)方法证实,获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体,抗体效价为1∶40000,经济效益可观。     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.     

尼罗罗非鱼PPARδ的原核表达及其多抗制备和纯化

【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体pET-B2m中,构建重组表达载体;重组质粒转入大肠杆菌B21并用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。用镍柱纯化重组蛋白后免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性。【结果】成功构建了原核表达载体pET-B2m-PPARδ,实现了重组蛋白的原核表达和纯化,重组蛋白以包涵体蛋白和可溶性蛋白2种形式存在,分子量约为90 kD;制备的多克隆抗体效价为1∶2 048 000,Western Blot检测结果表明该抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PPARδ。【结论】成功实现了尼罗罗非鱼PPARδ重组蛋白的融合表达,在大肠杆菌中高效表达后纯化重组蛋白,免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体,为尼罗罗非鱼PPARδ的功能研究奠定了基础。     

鸡Toll样受体2的克隆表达及多克隆抗体的制备

试验旨在制备鼠抗鸡Toll样受体2(chTLR2)的多克隆抗体。采用RT-PCR方法从活化的鸡外周血淋巴细胞中扩增其胞外区片段chTLR2(chTLR2t1和chTLR2t2),并构建这两个片段的原核表达重组质粒,优化蛋白质的表达条件,SDS-PAGE和Western-blot法检测融合蛋白,将融合蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用相应的原核表达的全长蛋白检测特异性抗体滴度。结果显示,成功获得chTLR2的胞外区片段,构建的原核表达重组质粒经IPTG诱导能成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价分别为1∶16 000和1∶10 000。表明制备的鼠抗chTLR2多抗具有良好的特异性,为进一步研究chTLR2的功能提供了重要材料。     

施用南荻生物炭对水稻养分利用特征的影响

为实现南荻秸秆炭化利用,缓解洞庭湖区因秸秆处置不当造成的环境压力,评估南荻生物炭农用增效潜力,本研究选用南方第四纪红土母质发育的红黄泥和花岗岩母质发育的麻砂泥水稻土,设置6个不同用量的南荻秸秆生物炭处理（质量比0、1%、2%、4%、6%和8%,0~20 cm土层）,采用水稻盆栽试验,探究南荻秸秆生物炭不同施用量对两种类型土壤水稻养分利用特征的影响。结果表明,南荻秸秆生物炭不同施用量和土壤类型对水稻各器官及地上部干物质累积、养分吸收均有影响。与不添加生物炭相比,添加生物炭处理下的麻砂泥和红黄泥水稻地上部干质量分别提高了0.6%~18.6%和15.5%~42.4%;添加4%生物炭的麻砂泥水稻地上部氮、磷和钾养分累积量分别提高了 8.6%、10.5%和 82.5%,红黄泥水稻分别提高了 33.8%、100.0%和 125.3%;二次回归方程与肥炭耦合模型拟合表明,麻砂泥和红黄泥水稻氮素利用的生物炭适宜添加量分别为2.51%和4.80%,磷素利用的生物炭适宜添加量分别为 4.33%和 7.03%,钾素利用的生物炭适宜添加量分别为 4.67%和 4.81%。因此,施用南荻生物炭有利于促进水稻氮磷钾养分累积和生长,生物炭添加量与土壤条件是影响肥炭耦合效应的重要影响因素。     

围垦对条子泥互花米草种群年季扩张特征的影响

为了解围垦对入侵植物互花米草种群扩张的影响,借助无人机航测技术,观测了2017年5月—2018年7月江苏盐城滨海湿地条子泥围垦大堤内外互花米草种群面积的年季变化,并结合实地监测数据,分析了土壤含水率、土壤盐度、生长地高程、地表水位对互花米草生长和种群面积的影响。结果表明：围垦显著降低了互花米草的扩张速度,观测期间堤内面积增幅为21%,而未围垦的堤外增幅超过400%,且互花米草扩张具有明显的季节性,堤内和堤外快速扩张的季节分别为秋季和夏季;围垦区土壤含水率和盐度分别较围垦区外平均降低25%和50%;互花米草植株高度与生长地高程之间存在显著正相关性（P<0.01）;互花米草种群的扩张距离与地表水位呈显著正相关性（P<0.01）。研究表明,围垦工程阻断了互花米草海水传播的途径,改变了围垦区土壤水盐条件,进而抑制了互花米草的扩张。     

生物质炭与草炭混配基质的养分状况及其对凤仙花生长的影响

为减少无土栽培对草炭等不可再生资源的依赖,促进农业废弃物资源化利用,本研究探讨以生物质炭替代传统栽培基质进行凤仙花栽培,通过盆栽试验研究了生物质炭及草炭不同比例混配作为生长基质对凤仙花生长的影响。试验设置了生物质炭与草炭不同的混配比例,分别是单一草炭基质（B0P5）,生物质炭与草炭体积比为1：4（B1P4）、2：3（B2P3）、3：2（B3P2）、4：1（B4P1）和单一生物质炭基质（B5P0）共6个处理,分析了不同配比基质的化学性质,并对各处理凤仙花生长情况及观赏指标进行了统计分析。结果表明,随着生物质炭添加量的增加基质pH逐步升高,添加生物质炭的基质（B1P4、B2P3、B3P2、B4P1、B5P0）pH分别为7.01、6.90、7.34、7.83和9.05,较单一草炭基质提高了18.76%~55.77%,且差异均达显著水平;B1P4处理和B2P3处理的基质有效磷含量分别为292.10、266.53 mg·kg^-1,较单一草炭基质提高28.57%、17.32%,差异达显著水平。适量添加生物质炭可有效调节基质pH、并提高基质有效磷含量,并促进凤仙花生长,其中B1P4处理株高在苗期、生长期、开花期和成熟期分别较单一草炭基质提高42.39%、81.83%、23.66%、24.72%。B2P3处理开花数最多,整个花期分别较单一草炭基质处理增加21.05%~133.33%,且差异显著。研究表明,草炭混配适量生物质炭可有效促进凤仙花生长,增加凤仙花观赏价值。     

基于葛渣肥料化利用的蚯蚓转化技术研究

为探索葛渣资源化利用新途径,通过室内蚯蚓养殖试验,研究了新鲜葛渣、腐熟葛渣及鲜葛渣与牛粪不同配比对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)生长繁殖的影响,以及蚯蚓堆制处理前后物料肥力属性的变化,并利用种子发芽实验判断蚯蚓堆肥效果.结果 表明,纯鲜葛渣和纯腐熟葛渣不利于蚯蚓生长和繁殖.蚯蚓在鲜葛渣和牛粪的复混物料中可以正常生长繁殖,10％鲜葛渣复混90％牛粪的物料更有利于蚯蚓繁殖.不同物料经蚯蚓堆肥处理后,总有机质含量显著降低,总养分含量显著升高,种子发芽指数有一定程度的升高,70％鲜葛渣复混30％牛粪经蚯蚓堆肥处理后的总养分含量为102.2 g·kg-1,比10％鲜葛渣复混90％牛粪高出57.7％.研究表明,蚯蚓生物处理技术可应用于葛渣肥料化利用中,采用70％鲜葛渣复混30％牛粪进行蚯蚓堆肥,资源化利用效果最佳.     

土壤中细菌HC5的分离鉴定及抑菌活性测定

为了筛选出对马铃薯晚疫疫霉菌（Phytophthora infestans）有较强拮抗作用的生防细菌,从马铃薯种植地的土壤中分离细菌,并通过平板对峙法,测定分离细菌对马铃薯晚疫疫霉菌的拮抗作用。经大量拮抗实验,筛选出一株细菌HC5,经形态特征观察、生理生化特性测定和16S rRNA基因序列分析,确定该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。抑菌试验结果表明,HC5菌株对辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、黄瓜尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、马铃薯晚疫疫霉菌、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）均有一定的抑制作用,尤其对马铃薯晚疫疫霉菌的抑菌效果显著,抑菌率达89%。采用PCR方法对菌株HC5进行多种抗生素合成基因的检测,扩增到786 bp的硝吡咯菌素片段和587 bp的氢氰酸片段,表明菌株HC5能够代谢产生这两种抗生素,单一或协同发挥拮抗作用。研究表明,菌株HC5是一株具有开发潜力的生防细菌。     

砂地柏果实提取物对棉铃虫生长发育的影响

测定了新杀虫植物砂地柏果实的不同提取物对棉铃虫幼虫生长发育的影响,结果表明,砂地柏果实的不同提取物能明显抑制棉铃虫幼虫的生长发育速率;砂地柏果实不同提取物对供试幼虫体内羧酸酯酶活性的影响作用不同,甲醇提取物和石油醚回流物能不同程度激活羧酸酯酶活性,而甲醇回流物则对羧酸酯酶有抑制作用     

UV-B辐射和施氮对满江红生长、矿质营养和抗氧化生理的影响

为探讨UV-B辐射和施氮对满江红（Azolla）生长、矿质营养和抗氧化生理的影响,以元阳梯田稻田满江红为材料,室内模拟UV-B辐射（0 kJ·m^-2与5.0 kJ·m^-2）和施N处理（无氮和0.06 g·L^-1氮）,研究其对满江红生长、矿质营养和抗氧化生理的影响。结果表明,与CK （0 kJ·m^-2、无氮）相比,UV-B+N（5.0 kJ·m^-2、0.06 g·L^-1氮）、UV-B辐射（5.0 kJ·m^-2、无氮）处理均显著降低满江红光合色素含量,抑制其生长,导致生物量显著下降。UV-B辐射与施N单独或复合处理均显著增加满江红的N含量与累积量,降低植株Mg、Ca的含量。UV-B辐射与施N单独或复合处理均显著增加满江红丙二醛（MDA）含量,提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性,降低类黄酮含量和过氧化物酶（POD）活性。此外,UV-B辐射导致满江红抗坏血酸（AsA）含量下降、总酚含量增加,UV-B辐射与N处理显著增强满江红的总抗氧化能力。相关性分析发现,类黄酮、类胡萝卜素含量与生物量呈显著正相关。双因素分析表明,UV-B辐射显著增加了满江红氮、总酚、MDA含量,提高SOD、GR活性与总抗氧化能力; N处理显著增加AsA、MDA含量及SOD、GR活性; UV-B+N处理对满江红的生长系数、生物量、磷、钙、镁、叶绿素a、类胡萝卜素、AsA、总酚和类黄酮含量及POD、SOD活性和总抗氧化能力的影响存在交互作用。综上,UV-B辐射增强会抑制满江红生长,导致满江红N含量与累积量增加,施氮不能缓解UV-B辐射对满江红生长的抑制效应。     

入侵植物黄顶菊不同器官和不同发育阶段DNA表观遗传多样性变化特征

DNA甲基化是植物DNA普遍存在的一种表观遗传修饰方式,不仅在植物快速适应新环境中发挥重要的作用,还参与植物生长发育和器官分化特异性过程。本研究通过构建优化的甲基化敏感扩增多态性（MSAP）体系来分析入侵植物黄顶菊不同器官和同一器官不同发育阶段的组织甲基化变异特征。结果表明：器官特异性MSAP体系利用筛选的13对引物共扩增536条条带,其中引物EhHM7对表观遗传多样性贡献率最大,多态性百分比为92.45%;发育阶段特异性MSAP体系利用筛选的14对引物共扩增407条条带,其中EcHM1对表观遗传多样性贡献率最大,多态性百分比为80.56%。甲基化类型变异结果显示,黄顶菊不同器官（根、茎和叶）间以及同一器官不同发育阶段（老叶和嫩叶）的组织间均表现出显著的甲基化水平差异性,半甲基化、全甲基化和整体甲基化三种甲基化变异类型中茎组织的甲基化发生率最高,分别达到30.28%、19.37%和49.66%,老叶组织的全甲基化和整体甲基化率显著高于嫩叶组织,分别达到33.29%和52.77%。主成分分析结果显示,黄顶菊叶片个体分布较根、茎的个体分布更为密集,且嫩叶较老叶密集,表明根个体间和茎个体间均存在较大的差异,这种个体差异大于黄顶菊叶片的个体间差异,且老叶的个体差异大于嫩叶,这种个体间差异在样品采集时不可忽视。所以,在利用表观遗传学方法进行黄顶菊入侵性的研究中,必须要制定科学的采样方案,把植物器官和生长发育阶段特异性作为一个重要因素考虑在内。     

改良剂对柴油污染土壤中黑麦草生理代谢的调节

开展了土壤柴油污染的单因素盆栽实验和柴油污染盐渍化土壤中添加锯末-硝酸铵-磷酸二氢钾的三因素正交盆栽实验,对黑麦草幼苗抗氧化酶活性和叶绿素含量进行了分析,探究了柴油污染土壤中黑麦草幼苗的生理变化与调节。结果表明,土壤柴油污染显著减小了黑麦草幼苗生物量,与对照相比,叶SOD活性在柴油浓度0.3%和0.9%时显著降低,POD和CAT活性在0.6%和0.9%柴油浓度下显著降低;根SOD活性在0.9%柴油浓度下显著增大,POD活性在0.6%和0.9%柴油浓度下显著下降。受柴油污染的盐渍化土壤,施加锯末体积分数为10%时,黑麦草幼苗叶POD和CAT活性显著增强,叶绿素a和叶绿素b含量显著增加;施氮量为0.3 g·kg^-1土时,黑麦草幼苗叶绿素a和叶绿素b含量显著增加。可见,土壤受柴油污染时,添加锯末和硝酸铵可有效调节黑麦草幼苗的生理代谢。     

臭氧氧化-苦草深度处理猪场废水对无机营养盐的去除效果初探

进行了经氧化塘和人工湿地处理的猪场废水的臭氧氧化-苦草深度处理研究,考察了不同浓度臭氧氧化处理无机营养盐(N、P)含量的变化,和臭氧氧化-苦草处理对去除无机营养盐的作用。结果表明,三个臭氧投加浓度(10、30、50 mg·L~(-1))分别使NO-2含量降低7.7%、17.6%和21.4%,使NO-3增加5.7、4.2和2.4倍,使PO3-4增加40.1%、26.0%和0.7%;臭氧氧化-苦草处理使TN、NH+4、NO-2、TP含量分别降低11.4%~15.7%、29.9%~34.2%、22.6%~40.7%和36.0%~38.0%,使NO-3含量增加0.4~1.0倍。结果表明,臭氧氧化可以使N、P的形态发生变化,且低浓度的臭氧投加就能达到显著效果,苦草显著促进臭氧氧化后猪场处理尾水中无机营养盐的去除。