青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究

【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1 211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调（P＜0.01）,而TNNI2极显著上调（P＜0.01）。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。     

松墨天牛核糖体蛋白（RPS15A）cDNA的克隆及农药胁迫对其表达的影响

【目的】研究不同类型农药胁迫下松墨天牛核糖体蛋白基因表达的变化,为靶标防治松树重要害虫松墨天牛提供理论依据和参考。【方法】从构建的松墨天牛cDNA文库中获得表达序列标签(EST),用Blast程序从GenBank数据库中查找同源序列,克隆得到松墨天牛的一个核糖体蛋白基因;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测11种农药胁迫下该基因的表达。【结果】从松墨天牛cDNA文库中获得1条EST序列与昆虫核糖体蛋白S15A(RPS15A)同源的基因,命名为MaRPS15A。MaRPS15AcDNA长504bp,含有5′、3′非编码区和长393bp的开放阅读框,编码130个氨基酸,预测的蛋白质分子质量为14.75ku,理论等电点为9.95。MaRPS15A与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)核糖体蛋白RPS15A的相似性为98%,与其他昆虫核糖体蛋白RPS15A的相似性大于88%。除溴氰菊酯外,其他农药胁迫导致MaRPS15A相对表达量下降。【结论】成功克隆了松墨天牛核糖体蛋白基因MaRPS15A(GenBank登录号:KJ930032)。大多数农药抑制了MaRPS15A的表达,表明松墨天牛受到了不利影响。     

花斑裸鲤GeHSP70基因的克隆及其对重金属Cu2+胁迫的应答

【目的】克隆花斑裸鲤GeHSP70基因,并进行生物信息学分析;研究正常和Cu2+胁迫条件下Ge-HSP70的表达模式。【方法】采用分子生物学技术克隆花斑裸鲤GeHSP70基因的全长cDNA,分析其生物信息学特征。采用Real-time PCR技术分析正常和0.01 mg/L Cu2+胁迫（胁迫0,12,24,48 h）条件下GeHSP70 mRNA在花斑裸鲤肝脏、肾脏、脑和鳃4个组织中的表达情况,并采用ELISA试剂盒检测肝脏、鳃组织中GeHSP70蛋白的表达水平。【结果】花斑裸鲤GeHSP70序列共1 387 bp,由123 bp的5′-UTR、592 bp的3′-UTR和672 bp的编码区构成,编码223个氨基酸;GeHSP70蛋白是疏水性蛋白,分子质量为11.15 ku,等电点为5.01,包含2个HSP70家族的特征序列：IDLGTTYS（11-18位氨基酸）和IFDLGGGTFDVSIL（199-212位氨基酸）。GeHSP70基因核苷酸序列与鲫鱼的同源性最高（93%）,在系统进化树中与同科或属中鱼种聚合成一个分支,显示出高度保守性。Real-time PCR结果表明,正常条件下花斑裸鲤GeHSP70在鳃组织中的表达量最高,其次是肝脏,在脑和鳃组织中表达量较低;随着0.01 mg/L Cu2+胁迫时间的延长,花斑裸鲤肝脏、肾脏和鳃组织的GeHSP70 mRNA表达量先升后降,在24 h表达量最高,而脑组织的表达量持续升高;GeHSP70在花斑裸鲤肝脏和鳃组织的蛋白水平表达量总体均表现为先升后降,表明Cu2+能够诱导GeHSP70的表达。【结论】成功克隆了花斑裸鲤GeHSP70 cDNA全长,在0.01 mg/L Cu2+胁迫下花斑裸鲤GeHSP70在mRNA水平和蛋白水平呈规律性应答,表明GeHSP70是潜在的反映水环境质量的生物标志物。     

花斑裸鲤GeHSP70基因的克隆及其对重金属Cu2+胁迫的应答

【目的】克隆花斑裸鲤GeHSP70基因,并进行生物信息学分析;研究正常和Cu~(2+)胁迫条件下GeHSP70的表达模式。【方法】采用分子生物学技术克隆花斑裸鲤GeHSP70基因的全长cDNA,分析其生物信息学特征。采用Real-time PCR技术分析正常和0.01mg/L Cu~(2+)胁迫(胁迫0,12,24,48h)条件下GeHSP70mRNA在花斑裸鲤肝脏、肾脏、脑和鳃4个组织中的表达情况,并采用ELISA试剂盒检测肝脏、鳃组织中GeHSP70蛋白的表达水平。【结果】花斑裸鲤GeHSP70序列共1 387bp,由123bp的5′-UTR、592bp的3′-UTR和672bp的编码区构成,编码223个氨基酸;GeHSP70蛋白是疏水性蛋白,分子质量为11.15ku,等电点为5.01,包含2个HSP70家族的特征序列:IDLGTTYS(11-18位氨基酸)和IFDLGGGTFDVSIL(199-212位氨基酸)。GeHSP70基因核苷酸序列与鲫鱼的同源性最高(93%),在系统进化树中与同科或属中鱼种聚合成一个分支,显示出高度保守性。Real-time PCR结果表明,正常条件下花斑裸鲤GeHSP70在鳃组织中的表达量最高,其次是肝脏,在脑和鳃组织中表达量较低;随着0.01mg/L Cu~(2+)胁迫时间的延长,花斑裸鲤肝脏、肾脏和鳃组织的GeHSP70mRNA表达量先升后降,在24h表达量最高,而脑组织的表达量持续升高;GeHSP70在花斑裸鲤肝脏和鳃组织的蛋白水平表达量总体均表现为先升后降,表明Cu~(2+)能够诱导GeHSP70的表达。【结论】成功克隆了花斑裸鲤GeHSP70cDNA全长,在0.01mg/L Cu~(2+)胁迫下花斑裸鲤GeHSP70在mRNA水平和蛋白水平呈规律性应答,表明GeHSP70是潜在的反映水环境质量的生物标志物。     

花斑裸鲤GeHSP70基因的克隆及其对重金属Cu2+胁迫的应答

【目的】克隆花斑裸鲤GeHSP70基因，并进行生物信息学分析；研究正常和Cu2+胁迫条件下Ge-HSP70的表达模式。【方法】采用分子生物学技术克隆花斑裸鲤GeHSP70基因的全长cDNA，分析其生物信息学特征。采用Real-time PCR技术分析正常和0.01 mg/L Cu2+胁迫（胁迫0，12，24，48 h）条件下GeHSP70 mRNA在花斑裸鲤肝脏、肾脏、脑和鳃4个组织中的表达情况，并采用ELISA试剂盒检测肝脏、鳃组织中GeHSP70蛋白的表达水平。【结果】花斑裸鲤GeHSP70序列共1 387 bp，由123 bp的5′-UTR、592 bp的3′-UTR和672 bp的编码区构成，编码223个氨基酸；GeHSP70蛋白是疏水性蛋白，分子质量为11.15 ku，等电点为5.01，包含2个HSP70家族的特征序列：IDLGTTYS（11-18位氨基酸）和IFDLGGGTFDVSIL（199-212位氨基酸）。GeHSP70基因核苷酸序列与鲫鱼的同源性最高（93%），在系统进化树中与同科或属中鱼种聚合成一个分支，显示出高度保守性。Real-time PCR结果表明，正常条件下花斑裸鲤GeHSP70在鳃组织中的表达量最高，其次是肝脏，在脑和鳃组织中表达量较低；随着0.01 mg/L Cu2+胁迫时间的延长，花斑裸鲤肝脏、肾脏和鳃组织的GeHSP70 mRNA表达量先升后降，在24 h表达量最高，而脑组织的表达量持续升高；GeHSP70在花斑裸鲤肝脏和鳃组织的蛋白水平表达量总体均表现为先升后降，表明Cu2+能够诱导GeHSP70的表达。【结论】成功克隆了花斑裸鲤GeHSP70 cDNA全长，在0.01 mg/L Cu2+胁迫下花斑裸鲤GeHSP70在mRNA水平和蛋白水平呈规律性应答，表明GeHSP70是潜在的反映水环境质量的生物标志物。     

低氧胁迫下斑马鱼鳃中核糖体蛋白基因家族的表达分析

为研究斑马鱼核糖体蛋白应对低氧胁迫的生物学功能，对低氧胁迫和常氧条件下斑马鱼（Danio rerio）鳃组织进行转录组分析，利用高通量测序检测了低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃转录组中核糖体蛋白家族基因的表达差异。结果表明：在两个不同浓度的低氧胁迫下，斑马鱼鳃组织中60个核糖体蛋白基因的表达量显著上调。其中大亚基核糖体蛋白基因35个，小亚基核糖体蛋白基因25个。在低氧胁迫下斑马鱼鳃中显著差异表达基因GO富集的前15条通路中，均包括核糖体蛋白基因，且其中的5条通路与核糖体蛋白组装合成相关。在富集到“translation”GO通路中，富集到44个核糖体蛋白基因。另外，利用前期筛选出的低氧条件下斑马鱼鳃中显著低表达的2个miRNAs，针对低氧下表达量显著上调的60个核糖体蛋白基因进行靶基因预测，结果表明：斑马鱼miR-455-3p可以同时靶向核糖体蛋白基因rpl13和rplp1来调控斑马鱼对低氧环境的适应。     

人核糖体40S亚基RPS11蛋白的原核表达和纯化

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,属于核糖体蛋白S17p家族,由RPS11基因所编码,主要存在于真核生物中。本研究通过PCR扩增RPS11基因,构建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,序列测定正确后,将其转入E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE分析后,利用亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆RPS11基因,构建了原核表达载体pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE分析证实表达目的蛋白正确。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析柱获得纯化蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

尖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选能够稳定表达的内参基因用于尖裸鲤Oxygymnocypris stewarti实时荧光定量PCR分析,以尖裸鲤血液、心脏、肝、脾、鳃、头肾、中肾、后肾、前肠、中肠、后肠、性腺、眼、垂体、脑、红肌、白肌和皮肤18个组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术比较了GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、HPRT1(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1)、RPL13(核糖体蛋白L13)、RPL19(核糖体蛋白L19)、RPL13a(核糖体蛋白L13a)、SDHA(琥珀酸脱氢酶亚基A)和ACTB(β-肌动蛋白)7个候选内参基因的表达情况,并采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行分析。结果表明:GeNorm分析显示,7个候选内参基因的平均表达稳定值(M)依次为RPL13=RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13和RPL13a的M值均最小(0.62);NormFinder分析显示,7个候选内参基因的M值依次为RPL13RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13的M值最小(0.30);BestKeeper分析显示,7个候选内参基因的标准差(S.D.)依次为RPL13RPL19GAPDHHPRT1RPL13aSDHAACTB,变异系数(CV)值依次为RPL13RPL19HPRT1GAPDHSDHARPL13aACTB,其中RPL13的标准差(0.84)和变异系数(4.54%)均最小;7个候选内参基因在尖裸鲤不同组织中的表达量存在差异。研究表明,7个内参基因中RPL13的表达较为稳定,可作为尖裸鲤实时荧光定量PCR分析的适宜内参基因,本研究结果可为尖裸鲤遗传学及分子生物学等研究提供基础数据。     

青海湖裸鲤eif5b基因克隆与初步功能分析

【目的】围绕青海湖裸鲤卵巢中的eif5b基因克隆和功能开展相关研究,为青海湖裸鲤的卵巢发育机制研究提供理论基础数据。【方法】采用RACE和RT-PCR克隆青海湖裸鲤eif5b全长cDNA序列,对其进行生物信息分析,通过表达研究对其功能进行初步分析。【结果】青海湖裸鲤eif5b全长cDNA序列为2 209bp,包含1 293bp开放阅读框,编码430个氨基酸。氨基酸序列同源性比较发现,克隆的eif5b与其他脊椎动物的亲缘性相近,同源性为75.7%～95.1%,处于系统进化树上同一分支;eif5b与其邻近基因lipt1的共线性在整个脊椎动物中高度保守。【结论】青海湖裸鲤eif5b表达于脑、垂体、鳃、心脏、脾脏、卵巢、精巢和肾脏,在3、6、9、12、18、24月龄卵巢中均存在表达。     

巴西橡胶树核糖体蛋白S6基因的克隆及生物信息学分析

核糖体蛋白S6是核糖体蛋白家族的重要成员,在核糖体中发挥重要作用。利用农业部橡胶生物学重点开放实验室获得的部分序列设计引物,采用3-′RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得一个核糖体蛋白S6基因的完整阅读框,该基因编码249个氨基酸的多肽,含有一个典型的真核生物核糖体蛋白S6结构域。在HbRPS6氨基酸序列中没有预测到跨膜区和信号肽,二级结构分析表明：HbRPS6属于混合型蛋白。对10个RPS6系统进化分析表明：巴西橡胶树的RPS6基因在进化上具有保守性,与植物类玉米的RPS5基因亲缘关系最近,而与动物和酵母的亲缘关系相对较远。该基因的克隆和生物信息学分析为深入研究其功能奠定了基础。     

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。     

鸡生长激素cDNA及其5''''端调控区的克隆分析

从肉用品种鸡构建的垂体文库中克隆分离了鸡生长激素ｃＤＮＡ,并作了核苷酸序列测定。克隆的鸡生长激素ｃＤＮＡ序列全长为７８９个碱基对,其中５＇非转译区为４０个碱基对,３’非转译区为１０１个碱基对,编码区为６４８个碱基对。通过序列比较分析,克隆的鸡生长激素ｃＤＮＡ序列与已报道的蛋用品种鸡生长激素ｃＤＮＡ序列的同源性为９６％,与鸭生长激素序列的同源性为８７％,但与火鸡生长激素序列的同源性只有５２％。通过ＰＣＲ技术,本研究还扩增了６个鸡品种的生长激素基因５’端调控区。尽管这些鸡品种的生产性能差异显著,但序列分析表明鸡生长激素基因５’端调控区十分保守。因而,鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或３’端侧翼序列的影响。另外,鸡生长激素对多人数量性状的影响也在本文中进行了讨论。     

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。     

大熊猫核糖体蛋白S17亚基基因（rps17）的克隆及序列分析

RPS17蛋白是核糖体40S亚基的组成部分,由rps17基因编码.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps17基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基rps17基因的异同,分别运用RT-PCR和PCR技术,从大熊猫肌肉组织的mRNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基S17基因的cDNA序列以及从总DNA中成功克隆了S17基因的结构基因序列.序列分析发现,大熊猫核糖体蛋白亚基S17基因的表达序列长为457bp,开放阅读框(ORF)为408bp,编码135个氨基酸的蛋白质.结构基因序列长2 368bp,含有4个外显子和3个内含子.拓扑预测显示,核糖体蛋白亚基RPS17的相对分子质量为15.52×103,PI为10.26,含有5个类型的功能位点,即:5个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个N-豆蔻酰化位点及1个核糖体蛋白S17Esignature位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性,其蛋白质的高级结构除褐家鼠外与其它物种也具有一致性.对大熊猫rps17基因及其表达的蛋白质结构的比较研究,旨在丰富和完善哺乳动物r...     

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。     

河流中青海湖裸鲤亲鱼的捕捞技术

在入湖河流的沙柳河中围捕青海湖裸鲤亲鱼需用网具长为15 m,网目为44 mm,由绵纶或纶制成的地拉网。在裸鲤最佳产卵季节(5～8月份),进行围捕。网滩应选择在水流较为平缓,河底较为平坦且鱼群较为集中的河段下网,采用垂直岸坡的围捕方法,效果显著。一般需用6人左右能完成作业。     

沙冬青胚胎晚期发生丰富蛋白基因序列及表达特性分析

从沙冬青叶片EST文库中获得了胚胎晚期发生丰富蛋白（LEA）基因cDNA全长序列,命名为AmLEA14。序列分析表明该基因全长579 bp,含有一个459 bp编码152个氨基酸的开放阅读框,推测编码的蛋白质分子质量为166 ku。二级结构预测显示此编码蛋白属于第4类LEA蛋白。系统发生分析表明,此编码蛋白与大豆LEA14蛋白（P465191）的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,AmLEA14的表达量在低温、干旱、盐胁迫条件下升高,但是主要在低温胁迫后期富集。推测AmLEA14基因可能在沙冬青抵御低温、干旱、盐胁迫中发挥作用,主要是参与沙冬青的低温防御机制。