溶葡萄球菌素的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】制备溶葡萄球菌素(lys)的多克隆抗体,为检测其在转基因细胞、胚胎及转基因动物中的表达奠定基础。【方法】以含有lys基因成熟肽序列的PEPB质粒为模板,经PCR扩增,构建pET28a-Ly原核表达载体,并以其转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并纯化蛋白后,常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。【结果】构建的原核表达载体pET28a-Ly经IPTG诱导6h后即可高效表达lys蛋白,蛋白经纯化后,其质量浓度可达到3.05mg/mL;抗体经ELISA检测,效价为1∶27 000,West-ern blot检测结果表明,抗体的特异性较好。【结论】成功构建了lys原核表达载体,所制备的lys多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

胡葱黄条病毒外壳蛋白的原核表达与抗血清的制备

设计特异性引物PCR扩增得到胡葱黄条病毒(SYSV-O)的全长外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体pET32a-SYSV-O CP,转化大肠杆菌诱导表达。结果表明,SYSV-O CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达,分子量约为46 kDa。用纯化表达产物免疫小鼠制备抗血清,Western blot检测结果表明,抗血清与SYSV-O的CP发生了强烈的特异性反应。使用该抗血清进行了田间样品的带毒检测。     

1株抗鸡CD8α链单克隆抗体的鉴定

[目的]获得研究鸡CD8分子的单克隆抗体。[方法]用自行设计的引物PCR扩增鸡CD8分子α链部分基因片段,构建2个原核重组质粒,该片段经原核表达和纯化后免疫BALb/c小鼠,最后将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,细胞上清液用ELISA检测。[结果]PCR扩增获得大小约为510 bp的基因片段。构建的pET-32a-CD8α导入大肠杆菌,诱导表达获得了大小为39 kD的融合蛋白H is-CD8α。融合细胞经亚克隆,其上清液用ELISA检测和筛选,获得1株稳定传代和分泌抗CD8α的抗体的杂交瘤细胞株。该株细胞被命名为C11。上清液的ELISA抗体效价达1：600。[结论]该研究以原核表达的CD8α为抗原制备了1株单克隆抗体。     

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α多克隆抗体的制备及应用

以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1 mmol/L IPTG在37℃诱导表达6 h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20 d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSV BJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。     

鸡Toll样受体2的克隆表达及多克隆抗体的制备

试验旨在制备鼠抗鸡Toll样受体2(chTLR2)的多克隆抗体。采用RT-PCR方法从活化的鸡外周血淋巴细胞中扩增其胞外区片段chTLR2(chTLR2t1和chTLR2t2),并构建这两个片段的原核表达重组质粒,优化蛋白质的表达条件,SDS-PAGE和Western-blot法检测融合蛋白,将融合蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用相应的原核表达的全长蛋白检测特异性抗体滴度。结果显示,成功获得chTLR2的胞外区片段,构建的原核表达重组质粒经IPTG诱导能成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价分别为1∶16 000和1∶10 000。表明制备的鼠抗chTLR2多抗具有良好的特异性,为进一步研究chTLR2的功能提供了重要材料。     

鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

鸡PEPT1抗原表位基因的原核表达及序列鉴定

根据GenBank的原鸡PEPT1基因保守区序列设计引物,PCR扩增得到PEPT1基因抗原表位区序列,将该序列定向克隆至pET22b(+)载体上,成功构建了pET-22b-PEPT1重组质粒。重组质粒在原核表达宿主Rosetta(DE3)中诱导表达出PEPT1抗原表位区蛋白,纯化的表达产物经过质谱分析鉴定,为进一步生产鸡肽转运载体PEPT1的特异性抗体奠定了基础。     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

为研究猪γ干扰素(poIFN-γ)的生物学活性及其在机体免疫应答中的作用机理,克隆并表达了猪IFN-γ基因。首先应用RT-PCR方法通过一对自行设计的引物从猪脾脏淋巴细胞中扩增了猪γ干扰素基因片段,分别将其定向插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-32 a中,经测序表明与已报道的核苷酸序列同源性为100%。接着将重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,得到高效表达。所表达的融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在,分子量分别为43.0和35.0 ku,与理论推算值相符。为研究IFN-γ在表达中结构的变化,采用上述2种融合蛋白分别作为免疫抗原和检测抗原。结果用GST-poIFN-γ免疫小鼠所诱导的抗体可与poIFN-γ产生特异性结合,表明不同原核质粒表达的猪IFN-γ仍保持其特有的结构。     

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达

根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核表达载体pET28a(+),构建原核重组表达质粒pET28a-IL-2和pET28a-△SIL-2,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,在22 ku和18 ku处有2条清晰的蛋白带,相同条件下pET28a-△SIL-2表达量较高.RNAstructure软件分析表明,pET28a-IL-2的mRNA5′端序列形成了复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在原核细胞中的表达有一定的影响.     

猪IL-10的表达及其免疫原性鉴定

为探明原核表达的重组猪IL-10对仔猪的免疫原性,根据GenBank公布的猪IL-10基因序列(登录号:L20001)设计并合成了扩增猪IL-10基因的引物。利用ConA刺激猪外周血淋巴细胞,通过RT-PCR扩增出pmIL-10完整基因及其成熟蛋白基因片段(pmIL-10),分别插入质粒pVAX1和pET32α(+),对猪IL-10基因进行原核与真核表达。利用纯化的重组蛋白免疫仔猪,制备抗血清,利用间接ELISA检测血清效价。将pVAX-pIL-10转染COS-7细胞,利用RT-PCR检测pmIL-10的转录,以间接免疫荧光(IFA)鉴定其与原核表达产物制备抗体之间的反应。结果显示:该试验成功获得了猪IL-10基因,重组菌pET-pmIL-10/Rosetta经IPTG诱导后,猪IL-10获得表达,目的蛋白表达量以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39.7%;以白油佐剂重组蛋白免疫仔猪可产生高水平的抗猪IL-10的抗体,经ELISA检测,P/N值可达到8,OD630吸光值可达1.875,该抗体与转染pVAX-pmIL-10的COS-7细胞发生明显的荧光反应,说明原核表达的重组猪IL-10免疫产生的抗体具有生物学活性,为日后利用猪IL-10抗体消除病毒感染中产生的内源性IL-10研究奠定了基础。     

猪BMP4基因原核表达及优化

构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。     

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。     

鸡γ-干扰素与新城疫病毒F蛋白抗原表位融合基因的构建与表达

[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。     

SV40-LT基因的原核表达及免疫原性检测

为了获得纯化的SV40-大T抗原(SV40-LT)及其特异性抗体,本研究利用原核表达系统高效表达了SV40大T抗原的高抗原指数区域,然后将纯化的大T抗原免疫试验兔,制备了相应的特异性抗体。经蛋白免疫电泳和ELISA方法检测,结果表明本研究获得的原核表达产物,不仅具有较好的免疫原性,而且能够诱导试验兔产生较高的抗体水平(抗体效价为1∶6 400)。     

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。ELISA法获得OmpK抗血清效价达1∶1 600,Western-Blotting试验证实抗血清具有很好的特异性。OmpK菌株最佳诱导表达条件为:菌液OD600值0.8,IPTG终浓度0.3mmol/L,诱导时间8h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:不添加葡萄糖,转速230r/min,装液量50mL。【结论】成功制备了OmpK蛋白多克隆抗体,确定了OmpK蛋白菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。     

猪整合素αv多克隆抗体制备与应用

利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达,纯化目的蛋白免疫小鼠,制备猪整合素αv多克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后,截取胞外区抗原性较好的基因片段,针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上,诱导表达并纯化重组蛋白,对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价,利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400,且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体,为后续相关研究提供基础。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。