粳型优势生态型水稻Rf1a基因位点的检测

【目的】探明粳型优势生态型水稻中各品种(系)在Rf1a基因位点的差异,为粳型杂种优势群的利用提供基础数据。【方法】利用缺失设计引物Rfa-7F/Rfa-7R在粳稻恢复系中可扩增出957bp的片段,在保持系中可扩增出383bp的片段,对日本粳、台湾粳、韩国粳、巴西稻、美国粳、非洲IRAT粳、华北粳、非洲ITA粳、西北粳、东北粳、欧洲粳11个不同生态类型共60份材料进行PCR扩增检测。【结果】有14份材料是Rf1a/Rf1a基因类型,占所有材料的23%;日本粳、台湾粳、华北粳、西北粳和东北粳的所有材料是rf1a/rf1a基因类型,韩国粳、非洲ITA粳和欧洲粳有小部分材料是Rf1a/Rf1a基因类型,巴西粳、美国粳和非洲IRAT的大部分是Rf1a/Rf1a基因类型。【结论】粳型生态型水稻在Rf1a基因位点的差异,可以用引物Rfa-7F/Rfa-7R检测出不同基因类型,为粳型杂种优势群利用提供依据。     

V型小麦细胞质雄性不育“三系”及杂交种线粒体DNA的比较研究

以V型小麦细胞质雄性不育系及相应的保持系、恢复系以及其杂种F1为材料,用ISSR、SRAP、RAPD分子标记技术对它们的线粒体DNA进行了比较分析。结果如下:(1)153个SRAP引物组合中139个组合扩增出了多态性,9个组合扩增出不育系特有而保持系、恢复系、F1均缺失的片段,3个组合扩增出不育系特异缺失的片段。(2)92个ISSR引物中45个扩增出了多态性,筛选到了6个不育系特有而保持系、恢复系及杂种F1均缺失的片段。(3)288个RAPD引物中281个扩增出了多态性,4个引物扩增出不育系特有的片段,3个引物扩增出不育系特异缺失的片段。在对线粒体DNA进行分析时,SRAP比ISSR多态性好,比RAPD稳定性好。     

与粳稻BT型细胞质育性恢复基因连锁的实用SSR标记的筛选

以粳稻BT型细胞质育性恢复基因Rf-1位点的近等基因系、77个测交父本以及5个不育系与77个测交父本配制的178个测交组合F1为材料,利用义献报道的与Rf-1连锁的12对SSR标记引物,筛选近等基因系间与育性等位基因连锁带型一致的SSR标记,再用后者扩增测交父本,并调查测交F1植株的自然结实率,验证父本带型与育性恢复力的关系.结果表明:住12对SSR标记引物中,RM5629在六千辛A和六千辛B中均扩增出120 bp的片段,在恢复基因供体77302-1和8个近等基因系六千辛R株系中均扩增出110 bp的片段,在六千辛A/六千辛R的杂种F1中扩增出110 hp和120 bp的互补片段.6427 R系列、武育粳3号R系列、六盐189R系列、157TR系列、4016LHR系列、4016R和秀水04R同质恢复系以及8个常用的非同质恢复系的RM5629标记基因型与育性恢复力的符合率均为100%,3726R系列同质恢复系的标记基因型与育性恢复力的符合率为94.1%,平均为97.3% RM5629可作为Rf-1分子标记辅助选抒的实用SSR标记.     

转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因抗虫水稻的GUS和PCR辅助选择

报道了转基因抗虫水稻克螟稻1号（Ts-9)与非转基因恢复系川恢949、H97810－17及保持系212B等杂交F3代的GUS和PCR检测。GUS检测的结果，Ts-9与非转基因川恢949、97810－17杂交F2代有较多的GUS阳性植株。GUS阴性植株与阳性植株的分离比约为2：1。用设计合成的一对引物进行PCR扩增的结果，大部分GUS检测呈阳性的植株及一个保持系212B与Ts-9杂交F3代植株获得了大小约1200bp的PCR产物，即cryIA(b)基因片段。试验结果表明PCR是比GUS叶片染色更为灵敏、准确、方便的检测方法。     

水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf6功能标记开发及微核心种质中Rf6基因的筛选

核恢复基因Rf6是红莲型杂交水稻特有的新恢复基因,为了寻找更多具有Rf6恢复基因的种质,以扩展红莲型杂交水稻的恢复系来源,组配更多优良杂交品系,利用Rf6及其等位基因的序列差异,开发Rf6基因的功能标记,并利用该标记对中国水稻微核心种质进行PCR扩增,筛选具有Rf6恢复基因的种质。结果表明,在324 bp插入片段(Rf6较其等位基因插入324 bp)两侧设计引物(正向引物:5'-ATGACAAGAGGACCAGCGATGCAATGG-3',反向引物:5'-ATTCTTGCAGAGATAGACCATGAGCGTG-3'),利用该引物可扩增出条带清晰且无杂带的差异片段,可用于Rf6基因的鉴定。利用该标记在197份中国水稻微核心种质中筛选出22份具有Rf6恢复基因的种质,可为拓宽红莲型杂交水稻的恢复系来源提供材料。     

鹌鹑性别鉴定的分子标记方法

采用PCR方法扩增北京白羽蛋用鹌鹑基因组中性别基因CHD相关片段,探讨鹌鹑性别的分子标记方法。通过特异引物2550F/2718R,对3对已知性别和14只未知性别鹌鹑性别基因片段进行特异性扩增。结果表明,这对引物从雄性鹌鹑中扩增出1条片段,从雌性鹌鹑中扩增出2条片段,可以对鹌鹑的性别作出准确鉴定。该方法可以应用于初生鹌鹑的性别筛选,降低饲养成本,提高经济效益。对2条片段进行克隆测序,片段长度分别为613和446bp。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

洋葱细胞质雄性不育基因分子标记的开发

根据细香葱orf A501开发的特异引物,以洋葱细胞质雄性不育系为试材进行PCR扩增,对获得的片段进行回收测序,根据测序结果设计引物进行染色体步移,获得部分侧翼序列,开发了鉴定洋葱细胞质基因型的SCAR标记,命名为OC2175。该标记在洋葱不育系中扩增出一条2 175 bp的特异条带和1 053 bp的条带,而保持系中仅扩增出1 053 bp的条带。对17组不同遗传背景的不育系及其相应的保持系进行验证,该SCAR标记的鉴定结果与田间表型判断结果完全吻合。     

金刚鹦鹉性别的快速分子生物学鉴定

应用引物2550F/2718R对上海动物园内蓝黄金刚鹦鹉和红绿金刚鹦鹉的CHD基因进行PCR扩增,进行性别鉴定。经过琼脂糖凝胶电泳发现:雄性个体扩增出1条片段,大小647 bp;雌性个体扩增出2条片段,大小分别为630和411 bp。蓝黄金刚鹦鹉群体的雌雄比为10∶17,红绿金刚鹦鹉群体的雌雄比为5∶4。该方法能准确、快速、有效地进行2种金刚鹦鹉的性别鉴定,为该鸟类种群饲养繁育提供基础性别信息。     

中国冬小麦品种Waxy蛋白分析及分子标记研究

 利用SDS-PAGE分析了国内外306份小麦品种（系）Waxy蛋白的缺失类型，筛选出缺失Wx-B1蛋白亚基的材料46份；通过对济麦19×豫麦47的120个F2单株Waxy蛋白亚基分析，发现缺失Wx-B1的比例接近1/4，符合孟德尔分离规律。利用3个STS标记和1个SSR标记对不同Waxy蛋白缺失类型进行鉴定，验证其在分子标记辅助育种中的有效性。结果表明，Wx-7A位点的STS引物在野生型中扩增出1条1 172 bp的特异带，而缺失Wx-A1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带；Wx-4A位点的STS引物在野生型中扩增出1条440 bp的特异带，缺失Wx-B1蛋白亚基的突变材料中没有该扩增片段；Wx-7D位点的STS引物在野生型中扩增出1条940 bp的特异带，而在缺失Wx-D1蛋白亚基的突变材料中则扩增出1条360 bp的特异带；Wx-7D位点的SSR引物在野生型中扩增出1条204 bp的特异带，在缺失Wx-D1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带。这4个标记可以用于分子标记辅助育种。     

辣椒“三系”线粒体DNA的RAPD分析*

 对辣椒胞质雄性不育系、保持系及恢复系线粒体DNA进行了RAPD分析,共使用500条随机引物,其中有67个引物在“三系”之间都得到了扩增产物,19条引物扩增结果在“三系”之间表现出了遗传多样性。在不育系与保持系的线粒体DNA之间也发现了明显的差异,在辣椒胞质不育系中获得特异片段9条,这些差异片段与辣椒雄性不育的关系还需进一步研究。     

水稻滇一型不育系及保持系花药mRNA差异显示*

 运用mRNA差异显示技术,对水稻滇一型雄性不育系和保持系花药基因表达差异进行了比较研究。以专门设计用于差异显示的90对PCR引物组合,分析滇一型10对不同品系的不育系和保持系花药基因表达差异。结果表明:这90个引物组合均有扩增产物,扩增的cDNA片段在100～2000bp之间;不育系和保持系花药cDNA扩增带型相似。在这90个引物组合中仅有15对引物组合在单对的不育系和保持系间显示多态性,而且大多数的多态性引物组合仅扩增出一条差异带。在所找到的差异中,一般总是保持系有一条带,而不育系没有对应的带或是一条很弱的带。该结果表明不育系和保持系花药mRNA差异很少。所幸的是,在这些引物组合中,只有T8×P1引物组合(5′-ATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTG×5′-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3′)在10对不育系和保持系间扩增出一个共同的差异cDNA片断:保持系在750~1000bp之间有一条带,而不育系没有对应的带或是一条表达很弱的带,这很可能就是保持系和不育系的育性基因表达差异的结果。     

水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa7共显性功能标记的开发与应用

【目的】对水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa7进行精准检测和世代跟踪，通过分子标记检测Xa7基因材料的纯合或杂合型。【方法】根据Xa7、xa7和无等位基因型序列的差异，通过Premier 5软件设计了含4条引物Xa7-F、Xa7-R、Xa7null-F、Xa7null-R的功能标记Xa7fun，且采用PCR方法分别对不同遗传资源材料进行分子标记特异性检测和验证，自然高温下于孕穗期对含Xa7基因的3份杂交改良系及亲本采用剪叶接种法接种7个白叶枯病菌菌株进行抗性鉴定，并于成熟期考察记录其农艺性状。【结果】分子标记特异性检测结果表明，Xa7基因纯合型材料R084可扩增出大小为91 bp的条带，无等位基因型材料Nip可扩增出大小为153 bp的条带，杂合体Nip/R084可扩增出大小为91 bp、153 bp的条带，共显性标记Xa7fun得到的电泳条带与引物设计时预测的目标片段完全吻合；18份不同类型的种质资源均未扩增出91 bp大小的功能条带，说明这些材料均不含Xa7基因；杂交改良系Ry-1、Ry-2、Ry-3均仅含有91 bp大小的功能条带，表明Xa7基因纯合；在高温下，华占对7个菌株表现为高感...     

PCR技术在印度腥黑穗病菌检测和鉴定中的应用

利用2对小麦印度腥黑穗病菌（Tilletia indica Mitra)特异性引物（Tin3/Tin4,F3／R1）和2对黑麦草腥黑穗病菌T.walkeri特异性引物（Tin7/Tin8,Tin11/Tin4)建立快速鉴定T.indica及其近似种T.walkeri的PCR程序。引物Tin3/Tin4,F3/R1可特异性扩增T.indica分别得到415bp和498bp产物,扩增T.walkeri无产物;引物Tin/Tin8,Tin11/Tin4可特异性 扩增T.walkeri得到391bp和415bp产物,扩增T.indica无产物。4对引物扩增T.horrida、T.controversa和T.laevis无产物。产物片段的测序验证了PCR反应的可靠性。为进口粮检疫中T.indica的鉴定提供了快速、简便、实用的PCR诊断技术。     

菜薹细胞质雄性不育相关基因orf224的克隆

利用分子标记技术克隆菜薹雄性不育基因,为利用菜薹不育性提供依据.采用间源序列的候选基因法,通过检索NCBI核酸数据库,获得细胞质雄性不育(CMS)相关的基因或开放读码框序列.根据保守区设计1对特异引物.对不育系和保持系的基因组DNA进行PCR扩增.结果表明:特异引物在不育系中扩增出1条675 bp的片段.序列分析表明该片段与Pol型胞质不育orf224基因同源性为100%.CMS特异扩增结果证明试验所用的菜薹其不育类型为胞质Pol型.     

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法

针对转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)TT51-1及其回交后代中外源基因的检测建立了一种三引物多重PCR检测方法。结果表明,三引物PCR体系可以准确区分cry1Ab/cry1Ac基因纯合、杂合和阴性三种基因型,纯合体中只扩增出一条298 bp片段,阴性材料中只扩增出一条787 bp片段,杂合体中同时扩增出298 bp片段和787 bp片段。该体系的建立为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。     

百合炭疽病病原菌PCR检测技术

百合炭疽病是百合（Liliumlongifzorum）种球上重要病害之一,其病原为百合炭疽病菌（ColletotrichumliliiPlakidas）。通过百合炭疽病菌与常见胶孢炭疽病菌（C．gloeosporioides ）等4种不同炭疽病菌种类的核糖体DNAITS序列比对设计特异性引物,通过特异性检验,确定BT73／BT-RSl0和BT-F98／BT-R510。2对引物均可以分别扩增出438bp和413bp的百合炭疽病菌目标片段,而对常见4种炭疽病菌及百合球茎上2种常见的病原菌百合枯萎病菌及灰霉病菌均不能扩增出相同的目标片段。用引物对F73／BT-R510和BT-F98／BT-R510特异性PCR扩增百合炭疽病菌的灵敏度分别都在50pg以上。用外圈引物对F73／BT-R510和内圈引物对BT-F98／BT-R510进行巢式PCR扩增,对百合炭疽病检测的灵敏度提高不明显。     

水稻耐低温基因bZIP73分子标记的开发与验证

为能够对耐低温基因bZIP73的不同类型进行准确鉴别,根据粳稻bZIP73~(Jap)与籼稻bZIP73~(Ind)在编码区的一个碱基差别,开发了由4条引物组成的分子标记,并应用7份籼稻、7份粳稻及3份籼粳杂交的F_1材料对分子标记进行检测验证。电泳检测图显示,粳稻bZIP73~(Jap)扩增出681 bp和342 bp 2种条带,籼稻bZIP73~(Ind)扩增出681 bp和387 bp 2种条带,而籼粳杂合子F_1则扩增出681 bp、342 bp及387 bp 3种条带,所有材料的扩增条带大小与预测目的片段均一致,说明所开发出的分子标记能对基因bZIP73的不同类型进行准确判断。该方法具有费用低廉、操作简便、快速高效等优点,可在资源鉴定和育种中推广应用。     

一种快速、特异性检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata）的巢式 PCR 方法

为建立检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata ）的方法,从河南省小麦黑胚籽粒上分离得到7个优势 A．alternata 病原菌株,对其 rDNA 的内部转录间隔区序列（ITS）进行测序,序列比较表明,分离到的病原菌株与 GenBank 公布的 A．alternata 的 ITS 区序列一致性达到99％～100％。根据 Alternaria 属菌株（A．alternata、A．tenuis、A．tenuissima）和麦类根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana ）的 ITS 序列比对结果,设计出1对 A．alternata 特异性引物 Aa1F/Aa1R。利用多种河南省小麦的主要病原真菌对该引物的特异性进行验证,只有在 A．alternata 中能特异性地扩增出1条443 bp 的 DNA 片段。以真菌通用引物 ITS1/ITS4为外侧引物、特异性引物Aa1F/Aa1R 为内侧引物进行巢式 PCR 扩增,能检测到 A．alternata DNA 的最低质量浓度为50 pg/μL。因此,建立的巢式 PCR 方法能够快速、特异地检测小麦中的 A．alternata。     

粳稻三系亲本的杂种优势研究

本研究收集具有代表性的BT型粳稻不育系、保持系及恢复系各16个,共配制229个杂交粳稻组合,就粳稻的杂种优势问题进行了较系统的研究,结果：杂交粳稻普遍存在较强的中亲优势,但多数性状的超亲优势不强,在生长势上则表现非常明显的竞争优势。杂交粳稻大穗优势突出,但结实率多表现为负向优势,是目前制约杂交粳稻产量优势发挥的主要限制因素。