应用融合标签技术提高乳糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

双歧杆菌来源的乳糖酶具有催化效率高,安全性好等优点,在乳糖水解和低聚半乳糖生产等领域中应用潜力巨大。以来源于动物双岐杆菌（Bifidobacterium animalis B106）的乳糖酶基因bg42-106m为对象,将4种标签蛋白基因cherry、cbd(cellulose-binding domains)、gst(glutathione S-transferase)、mbp(maltose-binding protein)分别与bg42-106m基因连接,然后以pPIC9为载体构建融合蛋白重组表达载体,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达。结果表明,当融合Cherry标签蛋白基因后,可显著提高bG42-106M在毕赤酵母中的蛋白分泌表达量,培养基中乳糖酶活力可达到7.42 U/mL。与未融合标签的野生型菌株相比,乳糖酶bG42-106M的分泌表达量提高了290%。而其他3种标签蛋白没有提高bG42-106M的分泌表达量。     

凹凸棒土—壳聚糖耦合固定化乳糖酶及其在低乳糖乳制备中的应用

采用凹凸棒土吸附与壳聚糖溶液包埋耦合的方法进行乳糖酶的固定化.结果表明,当凹凸棒土∶壳聚糖为5∶1、吸附时间为4 h、加酶量为260 U.g-1时,固定化酶活力达107.6 U.g-1、酶回收率为50.6%;所制得固定化乳糖酶的适宜温度和pH值分别为40~45℃及6.4~6.8;用固定化乳糖酶水解牛奶中的乳糖,在温度为45℃时间为1.5 h时乳糖水解率即达69.5%,38℃、3 h水解率为71.3%.     

乳糖酶突变体库的构建及高活性突变体的快速筛选

构建了亮白曲霉来源的β-半乳糖苷酶活性中心的第219位丝氨酸的毕赤酵母饱和突变体库以筛选水解活性提高的乳糖酶。另外,通过以毕赤酵母发酵基础盐诱导培养基代替传统的BMMY培养基来诱导表达β-半乳糖苷酶和其突变体。结果表明,诱导时间在48~60 h且粗酶液中总蛋白量在0.2~0.8 mg/mL时,各乳糖酶的活力均高于其在BMMY培养基中的活力;各乳糖酶的比活力在此阶段保持相对稳定,且与纯化后的酶比活力呈正相关,即各乳糖酶的比活力高低可以粗酶液中乳糖酶的比活力来相对定量。在此基础上,利用高通量的48孔培养板创建了一种简便、高通量从β-半乳糖苷酶突变体库中筛选高水解活力乳糖酶的方法,并应用该方法快速地从突变体库中筛选到3个水解活力显著提高的突变体S-38、S-35和S-1,比活力分别提高了10.3%,9.2%和6%,高通量的筛选方法是定向进化技术中的重要环节,为其顺利开展奠定了基础。     

来源于嗜热古细菌Pyrococcus furiosus乳糖酶基因的原核表达及酶学性质分析

以嗜热古细菌Pyrococcus furiosus的基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得乳糖酶基因celB。将celB基因插入到表达载体pET．30a（＋）上构建原核重组表达质粒pET-celB,转化大肠杆菌B121,阳性转化子在28％下经IPTG诱导4h后进行SDS．PAGE电泳和酶活性测定,结果表明celB基因在大肠杆菌中获得高效表达,乳“糖酶基因celB表达的乳糖酶蛋白CELB分子质量约为58kDa。CELB是耐高温酶,其酶促反应最适温度为105％,在95％至110％之间热稳定性较好;pH5．0时该乳糖酶水解活力最高,在pH5．0～10．0之间,pH稳定性较好,该酶对金属离子依赖性不强。     

阳离子交换树脂D151固定化乳糖酶研究

以吸附率最高的阳离子交换树脂D151为载体,戊二醛为交联剂,用吸附交联法对黑曲霉乳糖酶进行固定化研究,优化固定化条件,以期改善乳糖酶性质,使黑曲霉乳糖酶适于低乳糖乳的生产。结果表明:固定化酶的最适温度为60℃,比游离酶低10℃;最适pH较游离酶稍向碱性方向移动;固定化酶比游离酶热稳定性降低;固定化酶与游离酶的酸碱稳定性有较大差异。在最适温度条件下,固定化酶较游离酶而言,在牛奶天然pH条件下使用更为适宜。在pH 6.5、50℃条件下,游离酶的半衰期仅为9 d;而固定化酶在此条件下反复使用20 d,仍具有59%的残余活力。该研究为工业化利用固定化酶生产低乳糖乳提供了技术依据。     

用于低乳糖牛奶生产的乳糖酶添加剂候选菌株筛选及粗酶性质研究

在低乳糖牛奶加工过程中需要高活性的低温乳糖酶作为添加剂。为此,从采集土样中分离纯化获得1株低乳糖奶加工过程中需要的高乳糖酶活性候选菌株,应用形态学和分子生物学方法,初步鉴定该菌株为动球菌属(Planococcus sp.),命名为Planococcus sp.Y。研究表明,该菌株是1株低温菌株,其最适生长温度为25℃,最佳生长pH值为7.0,所产酶为胞内酶,粗酶液的最适酸碱度和温度分别为pH7.0和25℃。     

黑曲霉乳糖酶固定化前后酶学性质比较研究

[目的]为低乳糖乳制品的工业化生产提供技术支持。[方法]以阳离子交换树脂D151为载体,采用吸附交联法对黑曲霉乳糖酶进行固定化,进而研究了固定化乳糖酶的酶学特性。[结果]固定化乳糖酶和游离酶的最适温度分别为60和70℃。在低于50℃的条件下对固定化乳糖酶和游离酶进行保温处理,酶活力没有损失;在高于50℃的条件下对固定化乳糖酶和游离酶进行保温处理,其酶活力呈现下降趋势,且固定化乳糖酶的活力下降更为迅速。固定化乳糖酶和游离酶的最适pH值分别为4．5和4．0,其pH值稳定范围分别为2．5—4．5和5．0～7．0。pH=6．5时,固定化乳糖酶和游离酶的活力分别为其最适pH值下的87．5％和3．8％。固定化乳糖酶和游离酶的半衰期分剐为24和9d。[结论]在牛奶的天然pH值下,固定化乳糖酶比游离酶更适用。     

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。     

一种海洋来源蜡样芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆表达及功能鉴定

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达.结果表明:BcgalA基因序列编码441个氨基酸,预测的BcGalA蛋白相对分子质量约为50 380,生物信息学分析显示,该酶属于GH4家族;酶活试验表明,在37℃、pH 8.0条件下该酶水解4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNP-α-Gal)、棉子糖的比活力分别为(1.498±0.034)、(0.261±0.012)U/mg,但对半乳甘露聚糖无水解活性.研究表明,本研究中克隆表达的BcGalA是一种属于GH4中仅对低分子量底物起作用的α-半乳糖苷酶,为探究GH4 α-半乳糖苷酶的结构与功能关系提供了样本.     

阳离子交换树脂固定化乳糖酶的研究

[目的]以阳离子交换树脂为载体,研究黑曲霉来源乳糖酶固定化条件,以期改善乳糖酶性质,使黑曲霉乳糖酶更适于低乳糖乳的连续生产。[方法]以吸附率最高的阳离子交换树脂D151为载体,通过先吸附后交联的方法固定乳糖酶,优化固定化条件。[结果]结果表明,加酶量为50．0U／g（载体）,吸附pH值为4．0,吸附温度是25℃,吸附时间24h,交联剂戊二醛浓度为4％,交联温度是30℃,交联时间是6h,固定化效果最好。获得的固定化酶活力可达11．8U／g（载体）,固定酶回收率为37．2％。[结论]该研究为工业化利用固定化乳糖酶连续生产低乳糖乳提供了技术依据。     

全蛋液酶改性工艺及蛋乳发酵酸奶的研制

试验对鸡蛋中蛋白质进行适当水解,将水解液与牛奶混合,经乳酸菌发酵制成具有清新蛋香和乳香味的蛋乳制品。结果表明,全蛋合理酶解条件为底物浓度3%,酶解温度50℃,酶解时间2 h,酶用量5 000 U·g-1。水解度27.22%,鸡蛋水解液中肽的Mr在1 000左右。水解液有明显蛋香味,无苦味。蛋乳酸奶合理工艺条件为配方鸡蛋水解液20%,糖8%,脱脂乳粉1%,其余用71%的牛奶补齐。发酵条件为菌种配比(Lb:St)1:1,添加量4%,发酵时间4 h,发酵温度42～43℃。制备的蛋乳酸奶色泽淡黄,具有明显的蛋香和乳香,产品凝固状态良好,口感细腻。     

饥饿对麻雀体内纤维素酶活性的影响

[目的]探讨饥饿对麻雀体内纤维素酶活性的影响。[方法]采用DNS法,测定自由进食和饥饿组麻雀体内纤维素酶活性的变化,并研究了pH和温度对纤维素酶活的影响。[结果]随着饥饿时间的延长,麻雀胃和肠道内CMC酶活先迅速下降后有部分上升,但未达到对照组的水平。饥饿组BG酶的活性持续下降。肌胃、腺胃、前肠、后肠和直肠中CMC酶活的最适pH分别为3、4、4、6和5。肌胃、腺胃、后肠和直肠的最适温度均为50℃,前肠的最适温度为40℃。BG酶活的最适pH均为4,最适温度为40℃。[结论]饥饿使麻雀消化道内CMC酶活先下降后上升,BG酶的活性持续下降。     

乳酸克鲁维酵母乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质

通过PCR扩增从乳酸克鲁维酵母基因组获得乳糖酶基因lac4,将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活性达(44.78±2.84)U/mL。利用Ni-ResinHP亲和层析技术纯化该酶,SDS-PAGE分析表明,重组酶分子质量约为122ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为43℃,37℃时半衰期为30min,最适反应pH为7.0,在pH4.0～10.0范围内有良好的稳定性,Ca2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Mn2+对酶有非常明显的激活作用,比酶活性为(255.55±2.32)U/mg,酶反应常数Km为3.49mmol/L,最大反应速率vmax为4.22mmol/(min.mg)。     

高产纤维素酶菌株的筛选

该研究从农田土壤中分离得到67株细菌,并从中选出一株高产纤维素酶菌株。将这些菌株接种到纤维素培养基上,在p H 5.5和28℃的条件下,利用刚果红染色溶液进行染色后,测其水解透明圈与菌落的比值的大小,进行初步筛选。将这些初筛的菌株接种到培养基中进行摇床培养后,制得粗酶液,并分析羧甲基纤维素酶(CMC)活力测定和滤纸酶(FP)活力及β-葡萄糖苷酶(BG)。在不同温度的条件下,对纤维素酶活力测定,最终筛选出曲霉A25(Aspergillus sp.)这一株菌株,最适酶活温度为50℃。产纤维素酶酶活力分别为:CMC酶活达2 340.92 U/m L;FP酶活达2.66U/m L;BG酶活达164.72U/m L。     

乌贼内脏酶解多肽的制备和抗氧化活性研究

[目的]探讨乌贼内脏酶解多肽的制备和抗氧化活性。[方法]以乌贼内脏为原料,用胰蛋白酶对其进行水解,采用单因素和正交试验方法研究酶解温度、酶解时间、加酶量和pH对水解度和抗氧化性的影响;通过检测羟自由基清除率、DPPH清除率和还原力评价不同分子量水解物多肽的抗氧化性。[结果]当酶解温度为35℃,时间为5 h,加酶量为5 000 U/g,pH为7.5时,水解度最大;当酶解温度为40℃、时间为7 h、加酶量为4 500 U/g,pH为8.0时,水解物对羟自由基清除率最大。超滤后不同分子量多肽对羟自由基的清除率为3～5 kD3 kD以下5～10 kD;DPPH清除率:3～5 kD3 kD以下5～10 kD;还原力:3 kD以下3～5 kD5～10 kD。[结论]乌贼内脏酶解多肽具有较好的抗氧化活性,不同分子量多肽的活性不同。     

酶法水解丝素蛋白最佳条件的研究

通过6种酶对家蚕丝素蛋白水解的试验表明,Alcalase 2.4 L水解效果最佳,Flavorzyme次之,并经正交试验确定Alcalase对丝素水解的最佳条件为:浓度8%的丝素溶液中加入1%的酶,在pH值85、5℃条件下反应6 h,水解度可达39.34%,回收率为76%。SDS-PAGE电泳实验证明,水解产物的分子量大致为6.2~7.8 kDa。在此基础上,添加1.5%的Flavorzyme继续水解,在pH值75、0℃条件下反应3 h,水解度为44.13%,回收率为59%。